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研究背景:
5-脱氧氟尿苷(5-deoxy-5-fluorouridine,5-DFUR)是临床治疗消化道恶性肿瘤的口服抗癌药物,为5-氟尿嘧啶(5-FU)的前体药物。其本身没有细胞毒作用,需要在细胞内经过胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)转化为5-FU才能发挥抗肿瘤作用。已有文献报道乳腺癌和胃癌细胞可以表达TP活性,而大肠癌细胞是否表达TP则持论不同。我们在前期研究中发现大肠癌组织中TP活性主要由间质细胞中的巨噬细胞表达,而测定6株结肠癌细胞系也几乎没有TP蛋白表达。在癌细胞不表达TP的情况下5-DFUR在结直肠癌组织中如何转化尚属疑问。有文献报道干扰素可以上调肾癌细胞及胃癌细胞TP的表达,另有体外实验证实干扰素可以上调TP的表达而增强5-FU及5-DFUR对大肠癌细胞的抑制作用。我们在前期的体外实验中也发现加入干扰素后可以使结直肠癌细胞对5-DFUR的半数有效量(IC50)下降。本实验拟通过对结肠癌小鼠动物模型应用5-DFUR、5-FU及与INF-α联合应用进行治疗,观察其对小鼠结肠肿瘤的抑制作用,为研究体内环境中5-DFUR转化机制提供依据。
实验材料：
1、实验动物 SPF级近交系BALB/c小鼠120只,6-8周龄,雄性,体重20.00±2.13g,购自中山大学实验动物中心。
2、肿瘤细胞株 BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株(CT26),购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。
3、实验药物5-脱氧氟尿苷(5-DFUR)由Roche公司日本研究中心提供；5-氟尿嘧啶(5-FU)注射液,江苏南通精华制药有限公司生产(批号：060507);聚乙二醇干扰素α-2a,商品名：派罗欣(180μg/0.5ml),购自上海Roche公司。
实验方法：
1、结肠癌模型制作方法先将体外培养的CT26细胞注入小鼠(BALB/c)背部皮下,约2周后基本可以形成肉眼可见的肿瘤隆起。将小鼠用3％的戊巴比妥钠麻醉后将固体瘤块取出,剪成直径约0.1 cm的碎块备用。将待接种的同种小鼠称量体重后以同法麻醉,于左下腹作一长约1.5cm切口进入腹腔,找到盲肠后在浆肌层作一荷包缝线,将肿瘤碎块包埋入浆肌层后以0号丝线逐层关腹。
2、动物分组及给药
(1)实验一：接种肿瘤后60只小鼠随机分为3组。5-DFUR组、5-FU组和对照组,每组20只。各组于手术后3天开始腹腔注射给药。根据动物体重,5-DFUR用量为0.1mg/g：5-FU用量为0.02mg/g;对照组腹腔注射生理盐水0.4ml;各组每天给药1次,连续5天。
(2)实验二：60只小鼠随机分为5-DFUR+IFN-α组、5-FU+IFN-α组和对照组,每组20只。结肠癌模型制作方法、各组小鼠腹腔注射5-DFUR、5-FU和生理盐水的时间、剂量同实验一。另外每组分别在术后第三天,每只小鼠颈部皮下注射IFN-α2μg。
3、观测指标
全部小鼠从结肠癌模型手术日开始,分别于术后1周、2周、3周分别测量小鼠体重并分别于术后2周、3周各组分别处死6只动物,开腹观察肿瘤与周围组织关系、有无肉眼可见肝脏转移。然后切除肿瘤记录肿瘤的重量,肿瘤及肝脏置-80℃冰箱保存。其它动物自然饲养,自术后第1天算起至动物自然死亡的时间为动物的荷瘤生存时间并记录。
4、统计学方法
应用统计软件SPSS13.0数据包对各组肿瘤重量采用H检验(Nemenyi法)进行比较,平均体重变化的差异和存活时间采用方差分析(ANOVA法)。当P<0.05时,认为差异有统计学意义。
结果：
1、实验一
(1)各组小鼠盲肠接种肿瘤生长情况(5-DFUR组、5-FU组、对照组)除1例未生长肿瘤小鼠外,其余处死鼠盲肠接种处均有肉眼可见肿瘤生长,大小不等,多呈鱼肉状外生性生长,没有完整的包膜,多与周围脏器粘连,但没有发现肝脏有肉眼可见转移肿瘤结节。部分较大的瘤组织拌有局部坏死或感染情况。坏死多为点状或片状坏死,感染则是在肿瘤表面附有脓苔。2周处死动物中,5-DFUR组6只中仅有2只有微小肿瘤生长,重量分别为0.10g、0..29g。5-FU组和对照组所有动物均有肿瘤生长,平均肿瘤重量分别为0.74±0.43g和0.64±0.50g,5-DFUR组与5-FU组及对照组的平均肿瘤重量相比较差异有统计学意义(P<0.05)。3周处死动物中,5-DFUR组有一只动物无瘤生长,其它小鼠平均肿瘤重量为0.29±0.26g,最大肿瘤为0.61g。5-FU组和对照组肿瘤明显增大,平均重量分别为1.13±0.75g和1.93±0.83g,最大的肿瘤重量分别达到2.03g和12.66g。5-DFUR组与对照组及5-FU组比较动物的肿瘤平均重量有统计学意义(P<0.05)。
(2)实验动物平均体重变化情况所有动物在术前、术后1周、2周、3周测量体重,从平均体重数据可以看到,各组小鼠在接种肿瘤和应用抗癌药物后体重都呈下降趋势,但5-DFUR组的下降曲线较为平缓,而且第3周时稍呈上升趋势。但是从统计学检验的结果来看各组动物平均体重的改变值之间比较没有统计学意义。
(3)手术后小鼠自然存活时间3组实验动物中,应用药物治疗后共有24只自然死亡,每组各8只。其中5-DFUR组、5-FU组、对照组动物的平均荷瘤生存期分别为33±9天、23±6天和20±4天。可以看出5-DFUR组动物有最长的荷瘤生存时间,5-DFUR组与对照组及5-FU组相比较均有统计学意义(P<0.05)。
2、实验二：
(1)不同组别小鼠盲肠接种肿瘤生长情况(5-DFUR+IFN-α组、5-FU+IFN-α组、IFN-α组)处死动物时肿瘤的生长情况和肉眼所见基本与实验一相同。2周处死动物中,5-DFUR+IFN-α组有3只动物没有肿瘤生长,平均重量为0.17±0.23g,5-FU+IFN-α组有最大肿瘤为0.6g,5-FU+IFNα组、IFNα组肿瘤平均重量分别为：0.47±0.11g、1.97±0.55g。3周处死的动物中5-DFUR+IFN-α组有一只动物没有肿瘤生长,平均重量为1.15±0.71g,5-FU+IFNα组、IFNα组动物肿瘤的平均重量分别为1.40±0.11g、1.19±0.74g。2周平均瘤重比较,5-DFUR+IFN-α组与IFN-α组比较有统计学意义(P<0.05);3周平均瘤重比较3组之间没有统计学意义。
(2)实验动物平均体重变化情况从各组动物术前、术后1周、2周、3周平均体重数据来看,5-FU+IFNα组、IFNα组小鼠平均体重在手术和应用药物治疗后均呈下降趋势,尤以5-FU+IFNα组最为明显,5-DFUR+IFN-α组小鼠的体重改变最为平缓,术后第3周呈比较明显的上升趋势。术后l周平均体重5-FU+IFNα组与其余2组比较均有统计学意义(P<0.05),5-FU+IFNα组动物体重的下降比其余2组要明显；2周和3周时小时平均体重3组间比较没有统计学意义(P>0.05),各组均呈轻微上升趋势。
(3)手术后小鼠自然存活时间3组实验动物中,每组各有8只动物自然死亡,平均带瘤存活时间为21±8天。5-DFUR+IFNα组平均带瘤生存期最长为24±9天。5-FU+IFNα组、IFNα组动物的平均带瘤生存时间分别为：21±9天、19±7天。各组均数比较没有统计学意义。
结论：通过本实验我们发现,在小鼠体内5-DFUR比5-FU具有更明显的抗肿瘤效果,而且副作用更轻微、动物的存活期更长。加入IFN-α未能显示5-DFUR的抗肿瘤作用增强。