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高等生物(动物和显花植物)的发育起始于精子和卵细胞融合受精的产物--合子,在不同的进化过程中,它们采用了不同的生殖策略,植物中的双受精现象就是区别于动物的特有的生物学过程,合子是新生植物个体发育的起点,合子激活是整个生命过程的开关,但是目前对合子激活的分子机理还了解的不多。为了回答这个重要的生物学问题,找到重要的开关激活因子(EmbryonicFactors,FAC),我们采用突变体分子遗传学的手段,以拟南芥为实验材料,试图去筛选上下游有联系的激活因子,进而去触及这个复杂的生物学过程。研究的主要结果如下:
1.突变体库的建立以及合子激活相关突变体的筛选(该部分工作和路秀丽合作完成,详细的遗传分析参见路秀丽论文)得到了EMS诱变可育个体16,000株,经过遗传筛选,最终得到29个FAC/fac。对这些突变体的各代的遗传分析表明:没有父母本效应的有16个,表现为通过雌雄配子体的传递频率是100%;有不同程度母本效应的有3个,表现为突变表型通过雌配子体的传递频率有一定程度的下降。
2.FAC6功能分析在我们鉴定的29个fac突变体中,我们对fac6进行了功能分析。结果表明:(1)该突变体胚胎有25%停滞在1-2细胞时期,另外还有25%的在合子期表现正常,但是到了球形期之后,开始表现出胚乳发育异常,但是胚胎可以发育到心形期。(2)胚胎和胚乳合子中有18.1%和18.7%均表现出细胞周期停滞在中期到后期;并且胚囊中表现出分裂相和间期核同时存在,细胞周期同步化受到破坏。(3)在球形期表现出突变表型的突变体中,胚乳核的细胞周期也停滞在中后期,且细胞周期同步化受到破坏,胚乳核变大,且不均等。(4)互交的结果表明,FAC6可能是一个母本效应的基因。(5)fac6突变体中,CyclinB1;1-GUS在15.55%的胚囊中表现出过度累积,这说明该突变体中细胞周期停滞在G2-M期,不能完成向后期转换。(6)FAC6编码一个APC/C(Anaphase-promotingcomplex,E3 ligase)的一个亚单位APC11,序列比对分析表明,该蛋白是一个很保守的蛋白,在哺乳动物和酵母中通过降解一定的周期素蛋白参与到细胞周期调控中。(7)基因表达分析表明该基因在旺盛分裂的组织细胞内高表达,且蛋白定位在细胞核内(70%)和细胞质(30%)内,与细胞核分裂相关。(8)amiRNA结果显示该基因降低表达后,幼苗也表现出与胚胎和胚乳一致的细胞周期缺陷表型。(9)父母本激活结合遗传数据表明,父本和母本在胚胎和胚乳中通过不同的机制调控其发育。父本在球形期开始的胚胎中是活性的,而母本在胚胎和胚乳中是活性的,它们有不同的活性状态,可能是表观遗传的结果。
总之,我们的实验结果表明,AtFAC6/APC11父母本在胚胎和胚乳中有不同的活性状态,可能通过促进细胞周期素蛋白CyclinB1的降解,在拟南芥的种子发育中发挥着关键的作用。