论文部分内容阅读
第一部分:骨质疏松症骨髓间充质干细胞的表征和免疫原性目的:间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)因其多向分化潜能和低免疫原性,在再生医学和组织工程中广泛应用,但有关疾病状态下的MSCs生物学特性鲜有报道。在本研究中,我们建立了卵巢切除(Ovariectomy,OVX)骨质疏松大鼠模型,比较源自健康和骨质疏松炎症微环境的BMSCs的三系分化潜能和免疫原性的差异。方法:采用卵巢摘除法,构建大鼠骨质疏松症模型;在确认骨质疏松形成的基础上,用全骨髓培养法分别从健康与骨质疏松大鼠骨髓中分离得到骨髓MSCs(Bone marrow-derived MSCs,BMSCs),分别命名为健康 BMSCs(H-BMSCs)和骨质疏松性BMSCs(OP-BMSCs)。(1)流式检测干细胞表型及细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测H-BMSCs 与 OP-BMSCs 的增殖效率。(2)H-BMSCs与OP-BMSCs经成骨诱导7天进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、实时荧光定量 PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测成骨相关基因;H-BMSCs与OP-BMSCs成骨诱导14天进行茜素红染色比较成骨分化效率;Western blot检测成骨Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达。(3)H-BMSCs与OP-BMSCs经成软骨诱导和成脂诱导,甲苯胺蓝染色、COL-2免疫荧光染色和qRT-PCR检测成软骨相关基因比较成软骨能力;油红-O染色和qRT-PCR检测成脂相关基因比较成脂能力。(4)采用流式细胞术检测H-BMSCs与OP-BMSCs表面共刺激分子的表达情况;将丝裂霉素处理的H-BMSCs、OP-BMSCs与CD3抗体活化的人T细胞共培养,CCK-8检测T细胞增殖;流式细胞仪检测T细胞早期活化的标志物;多因子检测(Cytometric Bead Array,CBA)T细胞共培养上清中细胞因子的分泌。结果:(1)OP-BMSCs与H-BMSCs具有相似的干细胞形态,表面标志物CD29和CD90表达无明显差异,不表达CD34、CD45;CCK-8结果显示在正常培养过程中,OP-BMSCs比H-BMSCs具有更弱的增殖效率。(2)与健康大鼠H-BMSCs相比,ALP染色和茜素红染色及量化结果表明OP-BMSCs的成骨能力减弱;qRT-PCR结果显示OP-BMSCs 中成骨相关基因骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达明显降低;Western blotting结果显示,在成骨诱导下,OP-BMSCs中β-catenin和成骨细胞特异性蛋白OCN和Runx2的表达显著下降。(3)甲苯胺蓝染色、免疫荧光和qRT-PCR结果表明OP-BMSCs具有较弱的成软骨能力;油红-O染色和qRT-PCR结果显示OP-BMSCs具有更强的成脂能力。(4)流式细胞术结果显示OP-BMSCs中正性共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达显著高于H-BMSCs,而负性共抑制分子PD-L1的表达显著降低;CCK-8结果表明OP-BMSCs不能抑制T细胞的活化;CBA结果显示OP-BMSCs促进活化T细胞分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),抑制抗炎因子白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)的分泌。结论:与健康大鼠H-BMSCs相比,来源于骨质疏松环境OP-BMSCs的成骨和软骨分化能力降低,脂肪生成能力和免疫原性增加。第二部分:基于钛亲和性DOPA-BMP-2多肽促进骨质疏松大鼠钛植入物骨整合目的:提高植入物(如钛基医用材料)与周边组织的骨整合是骨科患者治疗中的关键问题。通过引入生物活性分子有效调节骨形成,对于提高钛植入材料的骨生成,特别是特殊病理症状下(如骨质疏松症)的稳定性具有重要的意义。本部分在发现OP-BMSCs与H-BMSCs相比成骨能力减弱的基础上,开展基于钛亲和性DOPA-BMP-2多肽促进OP-BMSCs体外骨生成作用和体内骨整合的研究。方法:用浸泡法对钛片和钛钉进行表面功能化处理,经过儿茶酚氨基酸(Dopamine,DOPA)的接枝作用,将 BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)功能性生物活性多肽(DOPA-BMP-2)负载到钛片和钛钉上,用于实验。(1)比较各组之间的理化特性,采用X射线光电子能谱分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)检测各组改性表面的化学组成,采用水接触角(Water contact angle,WCA)检测各组改性表面的亲疏水性,采用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)检测各组改性表面的表面形态。(2)设置不同游离BMP-2多肽浓度,通过ALP染色和茜素红染色以及量化分析,探究不同浓度游离BMP-2多肽对OP-BMSCs的成骨能力的影响。(3)设置不同DOPA-BMP-2多肽浓度,通过ALP染色和茜素红染色以及量化,研究DOPA-BMP-2多肽改性表面对OP-BMSCs促成骨的最佳浓度。(4)通过ALP染色和茜素红染色以及量化,qRT-PCR检测成骨相关基因,研究不同比例的DOPA-BMP-2多肽和DOPA-RGD多肽(促进细胞粘附)对OP-BMSCs成骨活力的影响。(5)将涂覆DOPA-BMP-2多肽和DOPA-RGD多肽的钛钉植入骨质疏松大鼠模型体内综合评估骨整合,通过Micro CT分析各组骨整合的相关参数,硬组织切片行甲苯胺蓝染色分析骨-植入物接触与植入物总表面百分比(Bone-implant contact,BIC),生物力学测试检测锚固力。结果:(1)XPS的N元素含量上升证明生物活性多肽的成功接枝;WCA数据显示未接枝DOPA之前钛片疏水,接枝DOPA后变成亲水,有利于多肽的接枝;AFM结果显示接枝生物模拟活性BMP-2多肽后,钛片表面粗糙度增加;以上实验结果综合表明DOPA和BMP-2多肽成功枝接到钛表面。(2)ALP染色和茜素红染色以及量化结果均显示100 ng/mL的游离BMP-2多肽对OP-BMSCs促成骨能力最强。(3)通过形态学的染色结果可知,0.01 mg/mL DOPA和0.1 mg/mLBMP-2多肽组ALP染色和茜素红染色阳性区域最多。(4)ALP染色和茜素红染色以及量化结果均显示BMP-2:RGD=3:1对OP-BMSCs促成骨能力最强,qRT-PCR结果表明,OP-BMSCs经成骨诱导后,与对照组相比,BMP-2:RGD=3:1组成骨相关基因OPN和BMP-2表达量增加明显高于其他比例组。(5)Micro CT定量结果显示,DOPA-BMP-2多肽和DOPA-RGD多肽双功能化钛钉组骨体积分数(Bone volume/tissue volume,BV/TV),骨小梁数目(Trabecular number,Tb.N),骨小梁平均厚度(Trabecular thickness,Tb.TH高于其他组,骨小梁分离度(Trabecular separation,Tb.Sp)和骨小梁模式因子(Trabecular pattern factor,Tb.Pf)降低;甲苯胺蓝染色结果显示双功能化组促进骨整合;力学结果显示双功能化组力学性能增强;体内结果表明BMP-2:RGD=3:1双功能化组促进骨质疏松大鼠体内钛植入物骨整合。结论:生物模拟活性肽和双功能化策略成功促进骨质疏松症中钛植入物的骨整合。