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药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）一直是临床安全用药的重要问题。对乙酰氨基酚（Acetaminophen/acetyl-para-aminophenol，APAP）是众多引起肝损伤药物中的一个常见药。在治疗剂量时，它是一个安全的解热镇痛药，然而当超剂量(＞4 g/d)使用时，可以引起严重的肝损伤。 APAP经CYP450(cytochromeP450)酶代谢后生成的毒性产物NAPQI(Nacetyl-p-benzoquinone-imine)与线粒体蛋白结合形成APAP-Adducts(APAP proteinAdducts)，引起线粒体损伤和肝细胞坏死而导致急性肝损伤。实验室前期研究发现自噬可以移除APAP-Adducts而减轻APAP诱导的肝损伤，而p62与此有关。为了进一步探明p62在APAP肝毒性中的作用，我们利用p62基因敲除(p62whole body knockout,p62 WB KO和p62 liver specific knockout，p62 LS KO)小鼠进行了实验。实验结果显示在给予APAP后，p62基因敲除小鼠比野生型小鼠肝损伤更加严重，而且这种差异在给予APAP后24 h更为显著。同时p62野生型小鼠在给予APAP后24 h肝脏p62蛋白表达也明显升高。这说明p62在APAP诱导的肝损伤中发挥了重要作用，可能参与了肝脏的修复过程。此外，p62野生型小鼠在给予APAP后6h、24h，肝脏中的APAP-Adducts与基因敲除型小鼠相比明显减少，这说明p62的缺失抑制了肝脏中APAP-Adducts的清除。p62野生型小鼠在给予APAP后24 h，肝脏中PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)和Cyclin D1表达显著升高，而p62基因敲除型小鼠并未升高，这说明p62基因的缺失抑制了肝细胞的增殖。进一步实验结果表明p62基因缺失后不能激活其下游的mTOR信号通路，使p4EBP1(eukaryotic translation initiation factor4E bindingprotein1)表达减少，从而使细胞蛋白质合成受阻，抑制肝细胞的生长和增殖，使APAP造成的肝损伤不能得以修复。 APAP作为一线非成瘾性镇痛药，在西方国家常被关节炎患者长期服用以缓解关节疼痛。有临床报道长期服用APAP可导致中毒性肝炎、肝纤维化慢性肝损伤。在本研究中，我们首先观察了小鼠给予APAP后2、6、10周后引起的肝损伤。实验结果显示在给予小鼠APAP后6周和10周，肝脏HYP(hydroxyproline)含量显著升高，胶原合成增加，肝脏出现大量的胶原纤维沉积。此外，体外研究结果显示NAPQI可增加肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs) LX2中胶原的基因表达。这些结果说明长期给予APAP可诱发肝纤维化的形成，并且在此过程中，HSCs起了主要作用。肝纤维化发生发展的关键事件是HSCs的活化。活化后的HSCs表达α-SMA蛋白(α smooth muscle actin)，合成分泌大量ECM（extracellular matrix，ECM），使肝脏发生弥漫性ECM过量沉积而导致纤维化。在本研究中的体内和体外实验结果显示APAP和其代谢产物NAPQI均可诱导HSCs活化，使胶原、MMPs/TIMPs(matrix metalloproteins/tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases)和促纤维化因子TGF-β1表达增加，并激活ERK1/2-Smad2/3信号通路。EGR1（early growth response1）与组织纤维化关系密切。进一步的研究发现在APAP诱导的小鼠肝纤维化中EGR1的mRNA表达和核转位都明显增加。同样，NAPQI刺激LX2细胞12h后EGR1核转位也增加。提示EGR1可能参与了APAP诱导的肝纤维化。接下来用EGR1基因敲除小鼠来进一步确认EGR1在APAP诱导肝纤维化中的作用，结果表明EGR1基因缺失增加了小鼠对长期低剂量APAP诱导肝纤维化的敏感性，提示EGR1在抵御APAP诱导肝纤维化中发挥了重要作用。 绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)是中药金银花的主要药效活性物质。课题组前期研究结果已经发现金银花和CGA可拮抗APAP引起急性肝损伤(给予APAP后6h)。本研究在前期实验的基础上观察CGA对APAP肝损伤后修复(给予APAP后24h)的影响。结果发现给予CGA后12h可改善APAP诱导的肝功能损伤，并升高p62的表达，提示CGA可能是通过升高p62而改善APAP诱导的肝损伤。 穿心莲内酯(Andrographolide，Andro)是清热解毒中药穿心莲的主要活性成分。文献报道其具有抗组织纤维化的作用。本研究发现Andro和APAP合用的镇痛效果要优于单用APAP，且Andro本身也具有良好的镇痛作用。这提示Andro和APAP联合使用治疗关节疼痛具有可行性。接下来实验结果显示Andro可改善长期给予APAP引起的小鼠肝损伤，降低肝脏HYP的含量，减少肝脏胶原纤维沉积，由此说明Andro可有效抑制APAP诱导的肝纤维化。Andro在体内、体外均可抑制APAP或NAPQI诱导的HSCs激活，降低胶原蛋白和促纤维化因子TGF-β1的表达，并抑制ERK1/2-Smad2/3信号通路。但是Andro并未使EGR1的核转位进一步增加，提示Andro抑制APAP诱导的肝纤维化可能并不是通过EGR1。 总之，从本论文的研究结果来看，p62在APAP诱导的急性肝损伤的修复过程中发挥了重要作用，促进了APAP损伤后的肝脏修复，p62缺失则使损伤加重，长期给予APAP可引起小鼠肝纤维化，深入研究发现APAP通过激活HSCs和TGF-β-ERK1/2-Smad2/3信号通路诱发肝纤维化，EGR1的缺失则会进一步加重APAP诱发的肝纤维化，这对临床医生和长期服用APAP的患者具有非常重要的警示作用，并为以后APAP的长期毒性研究提供了方法和参考依据。绿原酸通过升高p62促进了APAP损伤后的肝脏修复，为绿原酸作为潜在的保肝药打下了扎实的实验基础。我们的实验证实穿心莲内酯不仅具有良好的镇痛作用，且能拮抗长期服用APAP诱导的肝纤维化，为将来穿心莲内酯和APAP合用治疗关节疼痛提供了可靠的理论依据。