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目的:
中药注射剂引起过敏反应的研究是中药注射剂临床前安全评价研究中的热点问题。通过对中药注射剂非临床安全性评价的回顾性分析发现,现行的过敏反应评价方法对于评价中药注射剂的致敏性在灵敏性和准确率方面尚待提高。基于此目的,本论文的研究,以大鼠品系差异比较为核心,对影响中药注射剂过敏反应评价的因素进行考察,同时对清开灵注射液、注射用灯盏花素两种中药注射剂的过敏反应进行了研究,为提高中药注射剂过敏反应评价方法的灵敏性和准确率提供理论依据。
方法：
1.采用Real-time PCR方法,对未致敏状态下,BN、F344、SD、Wistar四种品系大鼠血液、脾脏、肺组织中IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-18mRNA以及IL-4、IL-5、IL-13、IL-10mRNA进行检测;采用放射免疫法对血清中总IgE水平进行检测;采用酶联免疫吸附法对血清中总IgG、总IgM水平进行检测。2.以卵蛋白、天花粉蛋白为抗原诱导四种品系大鼠主动全身过敏(Active systemic anaphylaxis,ASA)反应,观察并初步提出、制定大鼠主动全身过敏症状表及全身致敏性评价标准。3.以卵蛋白、天花粉蛋白为抗原诱导四种品系大鼠被动皮肤过敏(Passive cutaneous anaphylaxis,PCA)反应,筛选较为敏感的大鼠品系,考察有无佐剂对PCA试验灵敏度的影响,考察大鼠抗血清致小鼠异种PCA试验与大鼠同种PCA试验灵敏度差异。4.以清开灵注射液和注射用灯盏花素为研究对象,采用大鼠ASA试验症状表及全身致敏性评价标准对这两种中药注射剂诱导的四种品系大鼠ASA反应进行评价;采用大鼠同种PCA试验和大鼠抗血清致小鼠异种PCA试验对两种中药注射剂的PCA反应进行评价;对两种中药注射剂致敏后四种品系大鼠脾脏IL-4mRNA表达及IFN-γmRNA表达的影响进行比较研究;对两种中药注射剂致敏后四种品系大鼠血清总IgE水平进行了检测。
结果：
1.未致敏状态下,BN大鼠即表现为Th2偏移型特征,Wistar大鼠则表现为Th1偏移型特征,F344大鼠和SD大鼠Th1/Th2偏移不明显;
2.未致敏状态下,BN大鼠血清总IgE、lgM水平远远高于F344、SD、Wistar大鼠;
3.未致敏状态下血清总IgG水平SD大鼠＞BN大鼠＞F344大鼠、Wistar大鼠;
4.通过OVA、TCS致四种品系大鼠ASA试验,初步制定大鼠全身过敏反应症状表及大鼠全身致敏性评价标准;
5.大鼠同种PCA试验结果显示:对OVA、TCS,四种品系大鼠在PCA反应强度上存在差异,其中BN大鼠最敏感;TCS加或不加佐剂均可引起四种品系大鼠的PCA阳性反应;OVA在没有佐剂参与的情况下不能使所有品系大鼠都产生PCA阳性反应,加入佐剂可明显提高OVA致四种品系大鼠PCA反应的阳性检出率。研究发现,SD大鼠和Wistar大鼠对TCS和OVA的敏感性恰好相反,SD大鼠对TCS的敏感性较高,对OVA敏感性低,Wistar大鼠对OVA敏感性高而对TCS敏感性低,这个差异在加入佐剂后表现得更加明显;
6.大鼠-小鼠异种PCA试验结果显示,异种PCA试验的灵敏度高于大鼠同种PCA试验:
7.ASA试验结果显示:Hartley豚鼠对清开灵呈弱阳性反应,对灯盏花素呈阴性反应;BN大鼠对两个中药注射剂均有弱阳性过敏反应,灯盏花素可引起F344大鼠强阳性过敏反应;大鼠同种PCA试验结果显示:加入佐剂可显著提高F344大鼠对灯盏花素的同种PCA阳性反应;大鼠一小鼠异种PCA试验结果显示:清开灵、灯盏花素加或不加佐剂阳性检出率高于大鼠同种PCA试验;灯盏花素致敏可引起BN大鼠、F344大鼠血清总IgE显著升高,清开灵使BN、F344、SD大鼠血清总IgE有升高趋势;清开灵和灯盏花素使BN、F344、SD大鼠脾脏IL-4mRNA/IFN-γ mRNA比值升高。
结论：
1.未致敏状态下,BN大鼠为Th2偏移型品系,Wistar大鼠为Th1偏移型品系,F344大鼠和SD大鼠Th1/Th2偏移不明显;
2.大鼠ASA试验中,BN大鼠最为敏感;在评价中药注射剂ASA反应时推荐BN大鼠ASA试验;
3.PCA试验中,为了提高检测方法的灵敏性,可采用加佐剂的方法,或增加大鼠一小鼠异种PCA试验;
4.SD大鼠和Wistar大鼠对OVA(5mg/只)和TCS(0.3mg/只)在PCA试验中显示的敏感性差异提示,在非临床安全性评价中对阳性药的选择应考虑动物品系的因素。
5.在本研究推荐的实验条件下,清开灵注射液和注射用灯盏花素可引起BN大鼠弱阳性ASA反应;致敏时加入佐剂或采用大鼠-小鼠异种PCA可提高两中药注射剂PCA试验阳性检出率;血清总IgE水平升高、脾脏IL-4mRNA/IFN-γ mRNA比值升高可能是清开灵注射液和注射用灯盏花素导致过敏的原因之一。