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包囊反应是昆虫清除体内大量病原微生物和大的生物外源物。整合素(integrin)是一类普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,是连接细胞外基质和细胞内环境信号转导的纽带。在昆虫中整合素对果蝇的生长发育及一些鳞翅目昆虫的先天性免疫反应起重要作用。为了研究整合素在小菜蛾血细胞黏附和包囊过程中的作用,本研究在已经克隆得到小菜蛾Px-Int cDNA(命名为PxlNT)全长序列的基础上,克隆了其保守序列762bp的片段,在原核细胞中进行了高效表达,运用纯化的Integrin制备了抗血清,以小菜蛾4龄幼虫为试虫,分析了小菜蛾integrin基因在血细胞黏附,包囊外源物过程中的作用。
根据本实验室已经克隆的小菜蛾β整合素(β-Integrin,Px-Int)基因的氨基酸序列,利用在线生物学软件ClustalW和BlastP分析了Px-Int和其它昆虫Integrin之间的保守序列。RT-PCR克隆了其保守序列中的762bp的片段,将该片段连接到表达载体pET-32a上,阳性重组子转化表达宿主菌BL21 (DE3)中,在IPTG诱导下进行了高效表达。SDS-PAGE检测表明Px-Int在大肠杆菌中可表达分子量约为44.0 kDa的可溶性融合蛋白,Western blot分析表明表达产物能与抗6His单抗特异性结合,即表达的Px-Int为C端带有6His标签的融合蛋白。将经Ni-NTA亲和柱纯化的Px-Int融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备了抗Px-Int的多克隆抗体anti-Px-Int。Western印迹检测结果表明,制备的抗血清可以特异识别表达的融合蛋白Px-Int。
为探讨Px-Int的时空表达差异性,RT-PCR检测了Px-Int在小菜蛾不同龄期的转录水平,结果表明,Px-Int在不同龄期都有表达,但在4龄幼虫表达量最高。RT-PCR对三龄幼虫的不同组织进一步检测表明,Px-Int特异性的表达于血细胞。为研究病原微生物对Px-lnt的诱导作用,RT-PCR检测表明,在4龄幼虫注射大肠杆菌菌液后,Px-Int的转录水平迅速升高,24h达到最高,一直持续到48h。SDS-PAGE和Westemblot检测显示,菌液处理4龄幼虫Px-Int的表达量随时间的增加而增加,在24h左右达到最高表达量,之后表达量逐渐降低。实验结果证明,细菌的诱导能瞬时增加小菜蛾Px-Int的转录和表达,转录和表达随时间的增加而增加,在24h左右达到最高。
为了证明Px-Int在血细胞粘附过程中的作用,用稀释不同倍数的anti-Px-Int血清处理小菜蛾的血淋巴,以封闭细胞表面表达的Px-Int蛋白,结果表明血细胞对载玻片的黏附能力因抗体浓度的上升而下降。2倍,5倍,10倍稀释的抗血清封闭的血细胞对载玻片几乎没有黏附能力,但随着浓度的降低,有少量细胞黏附,这与同浓度的Px-Int蛋白处理的血细胞对载玻片黏附实验结果相反。100倍稀释的抗血清对血细胞黏附能力的抑制明显减弱。结果表明Px-Int有增强小菜蛾血细胞黏附的重要作用。
为了分析Px-Int在血细胞包囊外源物过程中的作用,在体外用分别用anti-Px-Int,Px-Int,空白血清,lxPS处理的血淋巴包囊葡聚糖凝胶珠。结果显示,anti-Px-Int处理的血细胞对Sephadex凝胶珠的包囊能力明显受到抑制,在凝胶珠的表面几乎没有血细胞黏附。Px-Int蛋白处理组的血细胞对凝胶珠的包囊情况显著,并且伴随血细胞黑化现象。空白血清处理的血细胞对凝胶珠的包囊情况不明显,每个珠子上只有少量的血细胞黏附。用lx PS处理的血细胞对对凝胶珠轻微的包囊反应,且血细胞大量黑化。初步显示Px-Int在小菜蛾血细胞包囊反应过程中起着重要作用。
为了验证Px-Int在不同物种之间功能的相似性,以及进一步研究其在血细胞粘附与包囊外源物过程中的作用,实验采用模式昆虫家蚤的5龄幼虫进行包囊实验。结果显示,注射anti-Px-Int的家蚕幼虫,其血细胞包囊凝胶珠的能力大大下降,大部分凝胶珠的表面几乎没有细胞附着。抗原蛋白处理的幼虫,其血细胞有较轻程度的包囊。空白血清处理的幼虫的对照组,血细胞大量包囊凝胶珠,但包囊厚度小于凝胶珠的半径。lxPS处理的幼虫,其血细胞包囊凝胶珠的情况比较明显,并伴随着细胞黑化。实验可以初步得出,anti-Px-Int能够抑制家蚕血细胞的包囊反应,但不能证明抗原蛋白能够增加血细胞对外源物的包囊作用,这表明Px-Int在家蚕幼虫体内同样起着调节血细胞包囊反应的作用。