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长度为18-30个核苷酸(nt )的小RNA(sRNAs )广泛存在于动物、植物以及真菌中，是一类重要的RNA分子，在生物体的众多生物过程中发挥了至关重要的作用。早在上世纪80年代，人们就已经对sRNA进行研究，发现sRNAs是通过内切酶DICER-LIKE(DCL)加工产生。1999年在植物中首次发现和基因转录后沉默相关的sRNAs。随后大量研究表明，sRNAs可以在转录、转录后或翻译水平上通过与靶基因序列互补配对的方式调控基因表达，从而参与植物的生长发育、代谢进程以及响应各种胁迫反应的信号通路调控，具有重要的生物学意义。sRNAs在植物中存在广泛的变异，且在同一物种内不同材料之间的变异也广泛存在，并有报道sRNAs在种内变异可能与物种内的表型变异紧密相关。然而我们对种内sRNAs变异的类型与变异的内在分子机制还不清楚，这些限制了我们对植物表型变异的理解与分子育种的实践应用。
为了系统鉴定sRNAs的种内变异类型并解析其变异的分子机制，我们收集了两个玉米优良自交系B73和Mo17叶片组织的深度sRNAs测序数据，并收集了一个具有广泛遗传变异的玉米关联群体(338份优良自交系)相关时期叶片的sRNAs测序数据。该sRNAs数据集包涵了15.530亿条有效sRNAs序列。经过序列的质量筛选，我们获得了18~26nt的3.087亿条高质量的sRNAs序列。在我们获取的B73和Mo17叶片组织深度sRNAs数据集中，有1.546亿条sRNAs序列被特异地定位到B73参考基因组中，1.541亿条sRNAs序列特异地定位到Mo17玉米基因组，sRNAs序列分别覆盖了B73和Mo17基因组的6.98%和7.06%。依sRNAs在基因组中的分布来看，在B73中，38.47%的sRNA分布在基因间区，其次30.37％是基因区域；而在Mo17的基因组中，sRNAs有42.78%分布于基因间区，基因区域占比28.43%。sRNAs在B73和Mo17基因组中不同区域的分布存在一定的差异。基于表达丰度(RPM)大于等于0.6并在至少60个不同的自交系中同时检测到的标准，我们共获得了339797条特异的sRNAs，其中，B73基因组中检测到171813条sRNAs，Mo17中检测到167984sRNAs，同时在两个基因组中都检测到的sRNAs有156422条。进一步分析发现，B73和Mo17之间的sRNAs表达发生了一定程度的变化。在B73和Mo17的基因组中，分别发现了15391和11562条种内特异表达的sRNAs，同时，鉴定到3537条差异表达的sRNAs。
为了解析B73和Mo17之间的种内sRNAs变异的分子机制，我们在具有广泛遗传变异的关联群体中对1999条B73和Mo17之间具有两倍及以上差异表达的sRNAs进行了全基因组的表达关联分析，共鉴定到72671个与种内sRNAs变异显著关联的基因组SNP位点。进一步的关联位点去冗余分析，获得了5744个影响sRNA变异的反式eQTL。这些eQTL在玉米10条染色体中分布具有一定的偏好性，其中，第8号染色体鉴定到最多的eQTL(1633个)，其次是第2(1077)、1(731)号染色体中，第10(183)号染色体中鉴定到的eQTL最少。为了挖掘控制玉米全基因组种内sRNAs变异的关键调控因子，我们通过MontCarl模拟分析发现，这5744个eQTL中的反式eQTL显著富集于26.37Mb基因组区间内，其中调控大量sRNA变异的25个反式eQTL热点集中在2.2Mb的基因组区间内。在这些反式eQTL热点中，chr1，chr2和chr8上分布了三个主要的eQTL热点。在chr8号染色体的eQTL热点区域，有13个基因与其调控的469条种内变异sRNAs中的428条具有表达上的显著相关性。值得注意的是，469条被chr8号染色体的eQTL热点调控的sRNAs大都为24nt的sRNAs，存在显著的sRNAs长度富集。这些24nt的sRNAs主要与chr8号染色体的eQTL热点区域的三个基因具有表达相关性。这三个基因分别是Zm00001d008982,Zm00001d008983,Zm00001d008984，这3个基因可能主要参与了24ntsRNAs的合成与调控途径。同理，在chr2号染色体的eQTL热点调控了180条sRNAs的表达变异，其中，75条sRNAs为22nt的sRNAs。而这些22nt长度的sRNAs主要与chr2号染色体的eQTL的热点区域的一个功能未知的基因具有显著的表达相关。通过类似的关联分析与表达丰度相关分析，我们共鉴定到十个可以调控sRNAs表达变异的功能基因位点，这为我们深入研究作物中的种内sRNAs变异提供了重要靶位点，并加深了作物种内sRNA变异的分子机制的理解。
总之，本项sRNAs研究为我们提供了玉米全基因组中sRNAs分布特性与物种内两个基因组之间的sRNAs变异图谱。同时，全基因组的sRNAs表达关联分析，为我们鉴定了25个调控sRNAs变异的eQTL反式调控热点。这些结果加深了我们对物种内sRNA变异的理解，为更全面地理解物种内的表型变异提供了新视角。
为了系统鉴定sRNAs的种内变异类型并解析其变异的分子机制，我们收集了两个玉米优良自交系B73和Mo17叶片组织的深度sRNAs测序数据，并收集了一个具有广泛遗传变异的玉米关联群体(338份优良自交系)相关时期叶片的sRNAs测序数据。该sRNAs数据集包涵了15.530亿条有效sRNAs序列。经过序列的质量筛选，我们获得了18~26nt的3.087亿条高质量的sRNAs序列。在我们获取的B73和Mo17叶片组织深度sRNAs数据集中，有1.546亿条sRNAs序列被特异地定位到B73参考基因组中，1.541亿条sRNAs序列特异地定位到Mo17玉米基因组，sRNAs序列分别覆盖了B73和Mo17基因组的6.98%和7.06%。依sRNAs在基因组中的分布来看，在B73中，38.47%的sRNA分布在基因间区，其次30.37％是基因区域；而在Mo17的基因组中，sRNAs有42.78%分布于基因间区，基因区域占比28.43%。sRNAs在B73和Mo17基因组中不同区域的分布存在一定的差异。基于表达丰度(RPM)大于等于0.6并在至少60个不同的自交系中同时检测到的标准，我们共获得了339797条特异的sRNAs，其中，B73基因组中检测到171813条sRNAs，Mo17中检测到167984sRNAs，同时在两个基因组中都检测到的sRNAs有156422条。进一步分析发现，B73和Mo17之间的sRNAs表达发生了一定程度的变化。在B73和Mo17的基因组中，分别发现了15391和11562条种内特异表达的sRNAs，同时，鉴定到3537条差异表达的sRNAs。
为了解析B73和Mo17之间的种内sRNAs变异的分子机制，我们在具有广泛遗传变异的关联群体中对1999条B73和Mo17之间具有两倍及以上差异表达的sRNAs进行了全基因组的表达关联分析，共鉴定到72671个与种内sRNAs变异显著关联的基因组SNP位点。进一步的关联位点去冗余分析，获得了5744个影响sRNA变异的反式eQTL。这些eQTL在玉米10条染色体中分布具有一定的偏好性，其中，第8号染色体鉴定到最多的eQTL(1633个)，其次是第2(1077)、1(731)号染色体中，第10(183)号染色体中鉴定到的eQTL最少。为了挖掘控制玉米全基因组种内sRNAs变异的关键调控因子，我们通过MontCarl模拟分析发现，这5744个eQTL中的反式eQTL显著富集于26.37Mb基因组区间内，其中调控大量sRNA变异的25个反式eQTL热点集中在2.2Mb的基因组区间内。在这些反式eQTL热点中，chr1，chr2和chr8上分布了三个主要的eQTL热点。在chr8号染色体的eQTL热点区域，有13个基因与其调控的469条种内变异sRNAs中的428条具有表达上的显著相关性。值得注意的是，469条被chr8号染色体的eQTL热点调控的sRNAs大都为24nt的sRNAs，存在显著的sRNAs长度富集。这些24nt的sRNAs主要与chr8号染色体的eQTL热点区域的三个基因具有表达相关性。这三个基因分别是Zm00001d008982,Zm00001d008983,Zm00001d008984，这3个基因可能主要参与了24ntsRNAs的合成与调控途径。同理，在chr2号染色体的eQTL热点调控了180条sRNAs的表达变异，其中，75条sRNAs为22nt的sRNAs。而这些22nt长度的sRNAs主要与chr2号染色体的eQTL的热点区域的一个功能未知的基因具有显著的表达相关。通过类似的关联分析与表达丰度相关分析，我们共鉴定到十个可以调控sRNAs表达变异的功能基因位点，这为我们深入研究作物中的种内sRNAs变异提供了重要靶位点，并加深了作物种内sRNA变异的分子机制的理解。
总之，本项sRNAs研究为我们提供了玉米全基因组中sRNAs分布特性与物种内两个基因组之间的sRNAs变异图谱。同时，全基因组的sRNAs表达关联分析，为我们鉴定了25个调控sRNAs变异的eQTL反式调控热点。这些结果加深了我们对物种内sRNA变异的理解，为更全面地理解物种内的表型变异提供了新视角。