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NAC转录因子是植物特有的转录调控因子，对植物生长发育的不同阶段起调控作用。课题组前期研究表明，SNAC4/9与果实成熟密切相关。然而，关于SNAC4/9调控番茄果实成熟的具体机制仍不清楚。本研究对课题组前期利用ChIP-seq获得的SNAC4靶基因进行GO富集分析，深入挖掘成熟相关的SNAC4下游靶基因。基于CRISPR/Cas9技术，构建SNAC4/9单基因和双基因敲除载体，将载体在Micro-Tom番茄体内进行遗传转化，获得SNAC4/9单基因和双基因敲除突变体，为探究SNAC4和SNAC9转录因子调控番茄果实成熟衰老的差异机制提供技术和有效材料。主要研究结果如下：
1．GO富集分析表明，SNAC4的靶基因主要富集在生长素、乙烯、脱落酸和茉莉酸等植物激素信号转导相关通路中。
2．通过筛选成熟相关通路，在绿熟期番茄果实中，分别筛选出48、23、29、53和11个与生长素、乙烯、ABA、细胞壁代谢及果实着色相关的SNAC4靶基因；在红熟期番茄果实中，分别筛选出18、15、14、33和4个与生长素、乙烯、ABA、细胞壁代谢及果实着色相关的SNAC4靶基因。从筛选获得的靶基因中挑选了13个靶基因进行ChIP-qPCR验证实验，结果基本与ChIP-seq结果一致，证明了ChIP-seq数据的可靠性。
3．在SNAC4/9基因的CDS区分别设计了5个(4T1-4T5)和6个(9T1-9T6)靶点，并成功构建4个SNAC4单基因单靶点载体(命名为1/3/4/5号)、5个SNAC9单基因单靶点载体(命名为6~10号)、1个SNAC4单基因双靶点载体(命名为11号)、2个SNAC9单基因双靶点载体(命名为13/14号)、2个SNAC4/9双基因双靶点载体(命名为15/16号)和1个SNAC4/9双基因四靶点载体(命名为17号)。
4．挑选3个构建好的SNAC4/9单基因编辑载体(5号、11号和14号)和2个双基因编辑载体(15号和16号)进行番茄遗传转化，对阳性苗进行靶点测序，获得SNAC4基因突变体24株，SNAC9基因突变体9株，SNAC4/9双基因突变体1株。其中，5-8/5-9/5-11/14-12/14-14/14-17/14-61/16-20的靶点发生纯合突变。
5．对不同成熟时期11-31/16-70/14-57/14-61/16-20突变体果实进行初步表型观察，发现SNAC4/9基因的敲除导致番茄果实不能完全成熟。
1．GO富集分析表明，SNAC4的靶基因主要富集在生长素、乙烯、脱落酸和茉莉酸等植物激素信号转导相关通路中。
2．通过筛选成熟相关通路，在绿熟期番茄果实中，分别筛选出48、23、29、53和11个与生长素、乙烯、ABA、细胞壁代谢及果实着色相关的SNAC4靶基因；在红熟期番茄果实中，分别筛选出18、15、14、33和4个与生长素、乙烯、ABA、细胞壁代谢及果实着色相关的SNAC4靶基因。从筛选获得的靶基因中挑选了13个靶基因进行ChIP-qPCR验证实验，结果基本与ChIP-seq结果一致，证明了ChIP-seq数据的可靠性。
3．在SNAC4/9基因的CDS区分别设计了5个(4T1-4T5)和6个(9T1-9T6)靶点，并成功构建4个SNAC4单基因单靶点载体(命名为1/3/4/5号)、5个SNAC9单基因单靶点载体(命名为6~10号)、1个SNAC4单基因双靶点载体(命名为11号)、2个SNAC9单基因双靶点载体(命名为13/14号)、2个SNAC4/9双基因双靶点载体(命名为15/16号)和1个SNAC4/9双基因四靶点载体(命名为17号)。
4．挑选3个构建好的SNAC4/9单基因编辑载体(5号、11号和14号)和2个双基因编辑载体(15号和16号)进行番茄遗传转化，对阳性苗进行靶点测序，获得SNAC4基因突变体24株，SNAC9基因突变体9株，SNAC4/9双基因突变体1株。其中，5-8/5-9/5-11/14-12/14-14/14-17/14-61/16-20的靶点发生纯合突变。
5．对不同成熟时期11-31/16-70/14-57/14-61/16-20突变体果实进行初步表型观察，发现SNAC4/9基因的敲除导致番茄果实不能完全成熟。