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第一部分大鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养及氧化应激模型的建立目的体外原代培养新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞并建立大鼠内耳血管纹边缘细胞氧化应激模型。方法出生2-3天的SD大鼠乳鼠断头后,在解剖显微镜下打开听泡,取出耳蜗外侧壁的血管纹组织。用0.1%的胶原酶消化血管纹组织制成细胞悬液后接种于细胞培养板中,置于培养箱(37℃,5%C02/95%02)中培养。用低浓度血清培养基和差异性贴壁的方法以除去大部分成纤维细胞,获得纯度较高的边缘细胞。在普通光学显微镜和免疫荧光显微镜下观察、鉴定培养的原代细胞。将纯化后的边缘细胞用不同浓度梯度的葡萄糖氧化酶在不同时间点处理细胞处理,用CCK-8及流式凋亡检测筛选出最适宜的浓度及时间点。结果在普通光学显微镜下观察到原代细胞在种板24小时后贴壁生长,边缘细胞呈多边形,边界清晰,多个单层细胞聚集生长可形成细胞岛,细胞顶端可见分泌小泡,后期较大的边缘细胞岛中央有部分细胞呈复层生长形成的‘’dome"结构。免疫荧光检测细胞表达角蛋白-18。CCK-8检测细胞活性发现在葡萄糖氧化酶浓度为50U/L(p<0.05)时显著抑制边缘细胞活性,故选定葡萄糖氧化酶的作用浓度为50U/L。在此浓度处理下,测定不同作用时间边缘细胞活性发现：4hr(p<0.05)组的细胞活性与对照组即出现差异,细胞活性降低,故选定作用时间为4hr。用50U/L葡萄糖氧化酶作用4hr后,细胞ROS水平和凋亡水平明显升高,细胞呈氧化应激表现。结论成功培养耳蜗血管纹边缘细胞并成功建立边缘细胞氧化应激模型。第二部分p110α及Foxo3a在边缘细胞中的定位表达及1v-p110a-siRNA真核表达载体的构建及筛选目的观察转录因子p110α和Foxo3a在离体的耳蜗血管纹边缘细胞中的表达及分布。探讨1v-p110a-siRNA真核表达载体的构建及筛选。方法免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察p110α和Foxo3a在离体的血管纹边缘细胞中的表达及分布。根据大鼠p110α在Genebank中的序列设计并合成3条siRNA真核表达载体,记作1v-p110a-siRNA-1,1v-p110a-siRNA-2和1v-p110a-siRNA-3。用1v-CON(阴性无关序列)和3条1v-p110a-siRNA病毒分别感染边缘细胞,检测感染后边缘细胞的p1100α的mRNA和蛋白表达水平,从中筛选出沉默效果最好的siRNA真核表达载体。结果在离体边缘细胞中,p110α在细胞核内及细胞质中都有表达,Foxo3a主要分布于细胞核中。慢病毒感染边缘细胞后36hr后即可观察到绿色荧光蛋白的表达,48-96hr时达到高峰。1v-p110-siRNA-2组p110α基因敲除率高达74%(p<0.05),选定认为1v-p110a-siRNA-2作为p110α的基因沉默真核表达载体。结论p110a, Foxo3a在边缘细胞中均有表达。成功筛选对p110α目的基因具有最佳沉默效果的siRNA真核表达载体。第三部分p110α/p-Akt/Foxo3a通路在边缘细胞氧化应激中的作用目的p110α/p-Akt/Foxo3a通路在边缘细胞氧化应激损伤中的作用机制。方法本实验分为四组：①阴性对照组,单纯培养细胞,未加任何处理；②氧化应激组,用50U/L葡萄糖氧化酶作用4hr造成氧化应激损伤,但不进行慢病毒转染；③无关siRNA病毒转染组,MCs被1v-CON转染后,再加入50U/L葡萄糖氧化酶作用4hr造成氧化应激损伤；④lv-p110a-siRNA感染组,MCs被1v-p110a-siRNA转染后,再加入50U/L葡萄糖氧化酶作用4hr造成氧化应激损伤。通过real time-PCR和western blot检测四组中p110α、p-Akt、Foxo3a、SOD2的基因及蛋白表达的变化。通过流式细胞仪检测各组细胞ROS的量和凋亡。结果通过real time-PCR和western blot检测发现在氧化应激组(②组)和无关siRNA病毒转染组(⑨组),p110α, p-Akt的1mRNA和蛋白表达明显升高(p<0.05),而Foxo3a和SOD2的mRNA和蛋白表达明显降低(p<0.05)。而在进行1v-p110a-siRNAi转染后,④组p110a,p-Akt的mRNA和蛋白表达水平明显降低,Foxo3a和SOD2的mRNA和蛋白表达水平明显升高。检测各组ROS和凋亡,发现②组和③组比对照组①,ROS量和细胞凋亡数目明显增高,而④组比③组,ROS量和细胞凋亡数目明显降低。结论沉默p1100α在边缘细胞氧化应激损伤中发挥保护作用,可降低边缘细胞中ROS的产生,增加SOD2的产生,减少了细胞凋亡。