论文部分内容阅读
RNA干扰(RNAi)是广泛存在于各种生物中，在进化上非常保守的一种转录后基因表达沉默的机制。随着RNA干扰技术的不断发展，大量的研究小组将RNA干扰作为高效实用的工具来对基因功能、信号传导通路以及疾病的发生机制进行研究。但是对于RNA干扰的调节机制却研究的很少，虽然有一些可以调控RNA干扰信号的蛋白质已经被鉴定并进行了功能的探讨。本实验室前人的工作已经证明：当高剂量的esiRNA进入实验动物体内或细胞内时，会引起RNA特异性的脱氨酶基因adar-1的转录水平上调，导致高剂量esiRNA干扰的效果不佳。而如果同时引入adar-1和eri-1基因esiRNA，则可以改善沉默靶基因的效果。这些现象引起对于adar-1基因启动子区域的关注。因此，后续的研究对adar-1基因启动子对于高剂量esiRNA诱导的响应进行了初步的探索。
在这部分工作中，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)为报告基因，构建了带有不同长度adar-1基因启动子区域的质粒，并将这些质粒和非特异性esiRNA共转染到转染CHO细胞中。通过观察细胞内绿色荧光的强度以确定能够响应高剂量esiRNA诱导的最小区段。实验结果显示：adar-1基因启动子能够响应高剂量esiRNA诱导的最小区段位于起始密码子ATG上游200bp以内。为了进一步确定响应诱导的启动子元件，对此200bp的序列进行了生物信息学的检索，将得分最高的PU.1启动子结合位点确定为响应高剂量esiRNA诱导的候选元件。既而，采用缺失突变的方法对该转录结合位点在esiRNA诱导adar-1基因转录上调中的作用进行了研究。结果发现，PU.1启动子结合位点缺失后，adax-1基因启动子无法响应esiRNA的剂量诱导，绿色荧光及培养基中分泌型碱性磷酸酶含量较对照组不再有差别；而当把该元件插入adar-1基因起始ATG上游180bp前端后，adaz-1启动子又恢复其对于高剂量esiRNA的响应。因此说明，高剂量esiRNA引起adar-1转录上调主要是通过其启动子的PU.1元件发挥作用的。为了证明转录因子PU.1在高剂量esiRNA引起adar-1转录上调中所其的作用，又将特异性的PU.1 esiRNA转染到CHO细胞中以沉默内源性PU.1基因，然后观察esiRNA上调报告基因转录的情况，结果发现：当内源性PU.1被knock down后，高剂量的esiRNA进入细胞后，不再能诱导adar-1转录上调，实验组较对照组荧光强度及培养基中分泌型碱性磷酸酶含量无明显加强。而当使用过量表达转录因子PU.1蛋白的方法模拟细胞对高剂量siRNA的响应时，培养基中分泌型碱性磷酸含量与假如高剂量esiRNA组相当。以上数据进一步确认了PU.1是参与高剂量的esiRNA诱导adar-1基因转录上调，从而影响RNAi干扰效率的关键调控因子。