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更为牢固、稳定,其信号强度更佳。通过本研究初步证明实验结果与预期结果一致,为构建HBV基因亚型全分型芯片及其临床应用奠定了基础。实验方法一、实验材料C型HBV病毒样本为本实验室保存;感受态JM109菌,pMD-18T质粒,rTaq酶,pyrobest酶限制性内切酶EcoRI、NcoI,VentR—（exo-）DNA聚合酶质粒提取试剂盒、PCR产物切胶回收试剂盒PCR扩增仪（Biometra Personal PCR system,Germany）生物芯片点样仪（Micro GrindⅡ600,Biorobtics Ltd,England）激光共聚焦扫描仪(Gene TACTM LSⅣ,Genomic Solutions Inc.USA)空气变温PCR扩增仪和原位延伸基因芯片盒（实验室自制）二、实验方法1.在NCBI数据库中收集A-H八种基因型HBV的全基因组序列。利用生物信息学软件进行分析比对。筛选出分型位点。2.根据选择的位点设计探针及引物,并且分析其特异性。3.通过SOEing法制备包含分型碱基位点的特异核酸片段并测序。4.利用不具有3’-5’外切酶活性的VentR—（exo-）DNA聚合酶通过常规PCR对制备出的特异核酸片段进行验证。5.制备基因芯片:处理片基,按预先设计好的微阵列点阵使用生物芯片点样仪将探针点到芯片上,水化,烘烤固定并且与基因芯片盒组装备用。6.以制备出的特异核酸片段作为模板进行芯片验证。结果1.通过生物信息分析,初步筛选出HBV基因分型的6个特异碱基位点。2.利用SOEing法成功制备出包含分型碱基位点的8个基因型特异核酸片段。3.已对制备出的HBV A-H 8种基因型特异片段的6个分型碱基位点做了PCR验证,结果与预期结果一致。4.以制备出的特异核酸片段作为模板进行芯片检测,结果与预期结果一致。结论1.SOEing法是一种简便引入点突变的方法。可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测所需的模板DNA序列。2.通过测序,常规PCR以及新型的核酸探针原位延伸基因芯片对制备的HBV特异核酸片段进行检测,证明了这些序列的准确性。3.初步证明新型的核酸探针原位延伸基因芯片盒能够进行HBV基因分型。