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第一部分筛选并鉴定单核细胞抗新生隐球菌免疫应答中关键性差异长链非编码RNA本部分将筛选在单核细胞抗新生隐球菌免疫应答中差异性表达的长链非编码RNA(LncRNA)。通过密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,通过CD14磁珠分选试剂盒分离单核细胞。用热灭活新生隐球菌刺激单核细胞12hr后,收集RNA,通过去核糖体二代测序技术筛选并鉴定其中关键性差异基因的表达谱,并用实时荧光定量PCR验证关键性LncRNA的表达情况。结果发现,与未刺激组相比,刺激组一共存在893个上调表达基因和349个下调表达基因;采用GeneOntology分析,其中701 个基因属于 Biological Process,698 个基因属于 Molecular Function,751 个基因属于Cellular Component。与未刺激组相比,用热灭活新生隐球菌刺激组中LncRNA PPP1R26-AS1表达明显下降(P<0.05)。纳入在上海长海医院和上海长征医院确诊为新生隐球菌病患者(n=20)和同期入院体检人员作为健康对照(n=20),分离单个核细胞,经实时荧光定量PCR检测PPP1R26-AS1的表达水平,结果显示,与健康对照组相比,新生隐球菌病患者外周血单个核细胞中PPP1R26-AS1表达显著增高(P<0.05),且与患者疾病严重程度相关。本部分结果提示PPP1R26-AS1可能通过影响患者单核细胞抗新生隐球菌免疫应答而参与发病机制。第二部分PPP1R26-AS1负向调节热灭活新生隐球菌诱导单核细胞促炎因子的产生本部分将探讨PPP1R26-AS1在单核细胞抗新生隐球菌免疫应答中的作用。构建PPP1R26-AS1过表达腺病毒载体,并转染入健康人原代单核细胞。通过Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray 检测系统对 ADV-PPP1R26-AS1、ADV-NC、BLANK组mRNA表达谱进行分析后,筛选其中与免疫相关信号通路有关的关键分子并用实时荧光定量PCR进行验证;进一步在新生隐球菌病患者和健康对照组外周血单个核细胞中检测相关分子的蛋白表达情况。结果发现与对照组相比,ADV-PPP1R26-AS1组中IL-1B和CCL3水平明显下降(P<0.05)。与健康对照组相比,新生隐球菌病患者血清中IL-1B蛋白水平明显下降(P<0.05),但CCL3差异无统计学意义。本部分结果提示PPP1R26-AS1可以抑制新生隐球菌诱导的单核细胞IL-1B的产生。第三部分PPP1R26-AS1通过TLR2负向调节热灭活新生隐球菌诱导单核细胞IL-1B的产生本部分将探讨PPP1R26-AS1对新生隐球菌诱导的单核细胞IL-1B产生的调控机制。采用实时荧光定量PCR检测过表达PPP1R26-AS1对热灭活新生隐球菌诱导的健康人原代单核细胞Toll样受体相关分子的表达。采用实时荧光定量PCR及western blot检测新生隐球菌病患者与健康对照组外周血单个核细胞中TLR2信号通路分子的水平。利用TLR2功能获得与缺失实验,检测热灭活隐球菌诱导后单核细胞IL-1B的表达。结果发现,与对照组相比,ADV-PPP1R26-AS1组TLR2表达明显下降(P<0.05)。与健康对照组相比,TLR2、MyD88和TRAF6在新生隐球菌病患者中的表达显著降低(P<0.05)。拮抗健康人原代单核细胞TLR2后,热灭活新生隐球菌诱导的单核细胞IL-1B表达被部分抑制;TLR2激动剂可以部分抵消PPP1R26-AS1对热灭活新生隐球菌诱导的单核细胞IL-1B的抑制作用(P<0.05)。本部分结果提示PPP1R26-AS1可以通过抑制TLR2表达调节新生隐球菌诱导的单核细胞IL-1B的产生。