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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种具有包膜的不完全双链DNA病毒，可引起人类急性自限性感染或慢性感染。慢性HBV感染是引起肝炎，肝硬化乃至肝细胞癌的主要原因之一，严重威胁人类的健康。 目前慢性乙型肝炎的治疗方式主要是α干扰素和核苷类似物药物。干扰素治疗有一定的毒副作用，且对HBeAg阴性患者治疗效果不佳，所以核苷类似物的应用越来越广泛。由于核苷类似物不能直接作用于cccDNA，因此核苷类似物的治疗是长期的过程。慢性乙肝病人接受同一核苷类似物治疗长期治疗后，由于HBV逆转录酶缺少3-5的校正功能，导致其容易产生耐药性突变而使治疗失败，病毒反弹，病情恶化等。由于病人往往在一种核苷类似物治疗失败后，会选用其他核苷类似物治疗，因此体内会出现针对多种核苷类似物的耐药突变。HBV多重耐药株对多种核苷类似物敏感性下降，严重影响治疗效果及预后。本文中用到的三种不同临床HBV克隆株MVGV，MVGVT，MGVT均含有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦三重耐药位点。既往对HBV多重耐药株的研究多集中于体外实验分析，为了更进一步研究这些多重耐药株在体内的表型特征，并探索有效的治疗方案，我们进行了本研究。 第一章为前言部分，首先概述了HBV的基本知识，包括HBV的形态与结构，HBV基因组特点和组成，HBV的转录和翻译产物，HBV聚合酶的生物学功能，HBV的复制生活周期，HBV的基因突变类型汇总;其次是目前HBV的抗病毒治疗药物，HBV耐药突变发生机理及总结，以及相关的动物模型研究进展。 第二章为针对临床上分离出的HBV多重耐药突变株在体外及体内水平的表型分析。将野生株质粒(WT)和三株含有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦三重耐药位点的HBV复制型质粒(MVGV，MVGVT，MGVT)分别转染Huh7细胞，于转染后72h收集细胞培养液上清和细胞裂解液。用ELISA方法分析HBsAg，HBeAg等病毒蛋白的表达情况，提取胞内HBcAg进行Western blot检测，提取细胞内核衣壳相关HBV基因组(HBV core-associated DNA)进行Southern blot检测。与WT相比，MVGV，MVGVT，MGVT突变株HBsAg、HBcAg水平有显著性下降，HBeAg的水平与野生型相当。与WT的复制水平相比，各耐药株的复制能力均明显降低。体内分析研究运用高压尾静脉注射将耐药株和野生株质粒注射到C57BL/6小鼠，然后分别在不同时间点采血及处死部分小鼠分离肝脏，利用ELISA，荧光定量PCR，免疫组化等方法分析耐药株的表型。ELISA结果显示，WT，MVGV，MVGVT的HBsAg与HBsAb的消涨相对应，随着HBsAg转阴，HBsAb慢慢转为阳性。MGVT的HBsAg持续的时间明显比野生型以及其他两株多重耐药株要长，而MVGV的抗体应答水平较高。 第三章主要是替诺福韦（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）对HBV多重耐药突变株治疗方式的初探。为了探索TDF体内给药的最佳有效浓度，我们首先对进行了尾静脉高压水注射野生型质粒的小鼠进行了不同浓度梯度TDF的腹腔注射给药。通过检测病毒粒子在血清中的动态水平变化及分析肝内抗原表达情况，确定了33.3 mg/kg/day的给药浓度可以有效清除HBV。进一步在多重耐药株(MVGV和MGVT)注射的小鼠中腹腔注射33.3mg/kg/day的TDF，结果发现，与没有给药组相比，虽然耐药株在小鼠体内复制水平低，TDF仍能抑制耐药株的复制。另外给药组小鼠外周血中HBsAg的下降速率均高于未给药组，然而耐药株的下降趋势缓于野生型。进一步分析肝内HBsAg以及HBcAg的免疫组化染色结果，野生型质粒的HBsAg和HBcAg阳性细胞率均有显著下降，MVGV的肝内HBsAg以及HBcAg阳性细胞率比没给药组分别下降了32％和26％，而注射了MGVT的肝内HBsAg以及HBcAg变化不显著。以上结果提示耐药株对TDF的敏感性低于野生型。 第四章总结了论文的主要创新点。本研究有助于了解多重耐药株的生物学特点及指导TDF的临床用药。