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胚胎早期发育的分子机理是发育生物学研究的核心问题。小鼠在哺乳动物发育生物学研究中具有其他实验哺乳动物无可比拟的优点:小鼠遗传和生理特点与其它哺乳动物相似,体积小,饲养管理方便、易于控制,生产繁殖快,抗感染力强,仔鼠大而世代周期相对较短,遗传背景非常清楚。因此目前小鼠已经成为研究哺乳动物胚胎发育生物学的首选模式动物。
小鼠的合子基因组活化发生在胚胎的2细胞后期,一般分为两个相继发生的转录活跃时段。第一个时段,发生在胚胎发育的1细胞期的transcriptionalpermissivestate后期,受cAMP调控;称作子代基因组的minoractivation,这个过程伴随着强烈、并且独立于第一轮DNA复制的合成。紧随其后发生的第二时段,以非常明显的转录活动为特征,所以被称作majoractivation,这一时段依赖于第一轮的DNA复制。根据目前的研究我们知道,minoractivation可能依赖于母源的蛋白的转录后修饰,如磷酸化反应,它可以以直接或间接的方式作用于RNA聚合酶,通过改变后者的活性从而影响第一次转录高峰。胚胎只有在顺利越过minoractivation后,然后才能进行majoractivation及后续的发育过程。因此,为了研究小鼠早期胚胎发育的分子机理,我们必须首先阐明哪些母源因子在受精后胚胎的合子基因组激活中起着作用,它们的分子机理是什么。
为了实现这个研究目的,本文以小鼠卵母细胞的totalcDNA为tester,4.5dpc囊胚的totalcDNA为driver,用抑制性减法杂交方法构建了卵母细胞特异的差减cDNA库。通过菌落的斑点杂交与PCR筛选,我们获得了基因Fbxw14片段,随后克隆到该基因的全长cDNA。通过对该基因的功能学实验和生物信息学分析,我们对于Fbxw14基因的功能有了初步的了解。
Fbxw14基因N端存在F-box结构域,C端含有WD-40序列,根据2004年确立的F-box蛋白命名法则,故命名为Fbxw14,该基因最初由日本的RIKENGenomeExplorationResearchGroup通过cDNA建库与自动化功能标记而得到,是一个功能未知的新基因。
RT-SouthernPattern杂交实验表明,在小鼠胚胎植入前的发育过程中,Fbxw14的表达量呈下降趋势。当胚胎植入后,Fbxw14的表达量逐步上升;对成体而言,由不同胚层发育而来的各脏器组织中,Fbxw14的表达量各不相同;即使由同一胚层发育来的各脏器组织(如心脏、脾脏和肌肉),Fbxw14的表达量也不一致,这说明Fbxw14的表达具有空间差异,并且这种差异可能与各脏器组织的功能有一定关联。
原位杂交实验结果表明,卵母细胞至二细胞期,Fbxw14分布主要在核区,随着胚胎的卵裂,Fbxw14均匀分布到囊胚各细胞中。6.5dpc和7.5dpc时Fbxw14主要集中在原条区,胚外脏壁内胚层中也有表达。9.5dpc到12.5dpc,Fbxw14的信号分布从背部沿体轴向脑部延伸,12.5dpc时,头部与背部有强信号表达。在cos细胞中的定位实验证实该基因编码非核蛋白。
Fbxw14反义RNA注射结果显示,胚胎体外发育受到抑制,无法通过2-cell期,并且在小鼠胚胎植入前的所有发育过程中,该基因反义RNA对于胚胎发育的抑制作用是持续的。
通过对于Fbxw14基因编码蛋白的生物信息学分析,发现除去F-box和WD-40以外,FBXW14仍然包含了许多重要的功能区,如N-豆蔻酰基化位点及N-glycosylation位点等,它具有跨膜结构,亚细胞定位预测显示定位于胞质中的溶酶体/囊泡细胞器膜上,推测它可能参与胞内的分泌通路,在蛋白的分选与降解中起着作用。
综上所述,Fbxw14是一个新的母源基因,它可能定位于溶酶体/囊泡细胞器膜上,作为信号通路的调控因子而存在,它的主要作用可能是识别和降解早期胚胎发育中不再需要的信号分子。