论文部分内容阅读
Collagen XV（ColXV）是位于基底膜最外层由3个ColXVα1链三聚化构成的MULTIPLEXINs 胶原蛋白亚类的一员。ColXV 通过与多种细胞外基质（ECM）蛋白相互结合在维持骨骼肌、心脏、皮肤微血管、眼球玻璃体的结构和功能以及调节肿瘤细胞粘附、迁移和浸润等方面发挥重要作用。肥胖发生过程中脂肪细胞数量的增多和单个细胞体积增大依赖于脂肪细胞细胞外基质高度的动态变化，胶原蛋白伴随肥胖的发生出现广泛的沉积而诱导脂肪细胞坏死和凋亡。研究发现在缺乏 VI型胶原的脂肪组织中能够伴随脂肪细胞体积的增大显著减少细胞死亡并改善全身胰岛素抵抗(Khan et al., 2009)。ColXV 作为连接脂肪细胞基底膜和基底膜外细胞外基质的重要组成成分在调节脂肪细胞细胞外基质重塑和脂肪细胞凋亡发生的作用机制尚不清楚。本研究旨在明确 ColXV调控脂肪细胞凋亡与 ColXV 介导的细胞外基质重塑诱导脂肪细胞凋亡的分子机制，并得到以下结果： 1. ColXV通过AMPK/mTORC1/S6K1通路促进脂肪细胞凋亡。在3T3-L1细胞中超表达ColXV显著促进Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达，抑制Bcl-2的表达（P＜0.05），干扰ColXV后作用相反。Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI染色和TUNEL染色显示， ColXV 处理使脂肪细胞凋亡早期和晚期数目显著增加，并促进染色质 DNA 的片段化（P＜0.05）。在无血清饥饿和棕榈酸诱导的凋亡模型下，ColXV 进一步促进 Caspase-3 (Cleaved Caspase-3)、Caspase-9 (Cleaved Caspase-9)、Bax的mRNA及蛋白水平的表达，抑制Bcl-2的mRNA 及蛋白水平的表达（P＜0.05）。同时，超表达ColXV促进 AMPK (p-AMPKAα1Thr183 、p-AMPKAα2Thr172)的磷酸化并抑制下游 mTORC1 (mTORC1Ser2448)和S6K1 (S6K1Thr389)的磷酸化(P＜0.05)，干扰ColXV后作用相反。同时，加入mTORC1抑制剂Rapamycin（Rapa）后，超表达ColXV显著降低mTORC1 (mTORC1Ser2448)和其下游S6K1 (S6K1Thr389)磷酸化水平(P＜0.05)。表明ColXV通过促进AMPK/mTORC1/S6K1通路诱导脂肪细胞凋亡。 2. ColXV通过FGF2/FGFR1信号调控细胞外基质重塑诱导的脂肪细胞凋亡。在正常水平以及MMPs抑制剂Ilomastat和激动剂APMA处理下分别验证ColXV对脂肪组织ECM重塑的影响。ColXV促进ECM组成成分Col I、Col VI、Fibronectin和基质金属蛋白酶抑制酶 TIMP-1、TIMP-2 的 mRNA和蛋白表达，抑制基质金属蛋白酶 MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05)，干扰ColXV后作用相反。同时，ColXV能够加剧Ilomastat处理下脂肪细胞细胞外基质的胶原沉积，缓解APMA诱导的细胞外基质组分降解。在脂肪组织去细胞后，使用共聚焦显微镜对脂肪组织ECM进行Z-Stack层扫和三维结构重建验证了 ColXV 的这一作用，并且 ColXV 能够减少金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9与ECM组分结合，抑制其解阮蛋白作用。此外，超表达ColXV抑制FGF2向其受体FGFR1表面富集，显著抑制FGFR1(Tyr653/Tyr654)及下游ERK1/2、AKT的磷酸化水平(P＜0.05)，逆转了FGF2诱导的Col I、MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平的上升和TIMP-1的mRNA和蛋白表达的下降。表明ColXV通过抑制FGF2/FGFR1信号调节细胞外基质中MMPs/TIMPs平衡诱导脂肪组织细胞外基质重塑。 综上所述，本研究表明ColXV通过促进AMPK/mTORC1/S6K1信号通路来诱导脂肪细胞凋亡。ColXV通过抑制FGF2/FGFR1信号调节细胞外基质中MMPs/TIMPs平衡诱导脂肪细胞细胞外基质重塑并进一步引发脂肪细胞凋亡。