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植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌,它们长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化。一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养;另一方面,内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。由于植物内生菌有着重要的生态和生理作用,所以它是潜在的生防资源和外源基因载体。同时,人们还发现植物内生菌能产生一些结构新颖、功能独特的天然产物,具有极高的应用价值。相对于植物而言,植物内生菌具有繁殖快,培养方便等特点,更利于工业化的生产应用,在农业和医药领域中有着巨大的应用潜力,因而受到了人们的广泛关注,已逐渐成为国内外研究的热点。
本文以菊科一年生草本植物黄花蒿(Artemisia annua L.)内生真菌为研究对象,分别于春秋两季在南京市郊及周边地区采集植株样品42株,针对其根、茎、叶等不同组织的内生真菌进行了分离和纯化,并对黄花蒿内生真菌的生态分布进行了初步研究。从42株黄花蒿样品中,我们共分离得到菌株473株,并对大部分菌株进行了初步归属,确定了不同样品中的优势菌群类型。初步分类后发现这些内生真菌具有明显的多样性,通过生态分布的分析发现黄花蒿植物的内生真菌的种类,数量及类型与采集时间,采集地点和分离部位都有一定关系。
同时通过微生物拮抗实验,我们共筛选了67株菌株的活性,其中35株具有体外抑菌活性,在抗菌活性研究中,我们发现从秋季在八卦州采集的样品的茎中分离的菌株Ar—八卦州茎-2和Ar—八卦州茎—5具有较强的广谱抗菌活性。除了活性筛选外,我们还对菌株的粗浸膏进行了1HNMR分析,通过实验室图谱的比对和实验室从事真菌次生代谢产物分离的经验进一步筛选出值得深入研究的菌株。
在此基础上,通过大规模液体发酵,本文对筛选出的活性菌株Ar-4茎-1的次生代谢产物进行了分析。从Ar-4茎-1的粗膏中共分离纯化得到13个化合物,其中有5个新化合物,已知化合物中有桔霉素类化合物—citrinin(化合物1),生物碱类化合物-N-acetylardeemin(化合物2),15b-B-hydroxyl-5-N-acetylardeemin(化合物3),细胞松弛素类化合物--rosellichalasin(化合物4),cytochalasin E(化合物5)。抗菌活性实验结果显示,化合物1对大肠杆菌Ecoli的MIC值为8.9 μg/ml,化合物4和化合物5分别对大肠,假单,白念都有一定的抑制作用。同时本文以DNA指纹法和传统形态学观察相结合的方法,并辅以化学分类法将菌株Ar-4茎-1鉴定为Aspergillus sp.。