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昆虫病原线虫斯氏属(Steinernema)与异小杆属(Heterorhabditis)线虫是国际上新型的生物杀虫剂。这类线虫分别与Xenorhabdus和Photorhabdus属的共生细菌共生,其感染期线虫的恢复发育以及共生细菌对昆虫寄主的毒性对于这类线虫的产业化培养和应用发挥十分重要的作用。
多种基因参与了感染期线虫的恢复发育过程。本论文对Xenorhabdus。nematophila共生细菌诱导的小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae A24两个差异表达基因(Sc-A24-466、Sc-A24-583)进行了原核表达,并对表达的Sc-A24-583蛋白进行了初步的功能测定。
小卷蛾斯氏线虫Steinernema. carpocapsae A24的发育相关基因Sc-A24-466与PE-PGRS蛋白家族有高达41%的相似性。以S.carpocapsae A24总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了Sc-A24-466基因,将目的基因与pET-15b表达载体进行体外连接,构建了重组表达载体pET-32(+)-Sc-A24-466;于重组菌的对数生长期前期加入诱导剂IPTG(1 mmol/L),37℃下诱导表达8 h~12 h后,获得分子量分别约为29 kDa和20.1 kDa的融合蛋白;融合蛋白以包涵体形式存在,利用His·Tag融合标签的免疫印迹检测发现了融合蛋白。这一基因的原核表达为其下一步的功能测定提供了基础。
小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae A24的发育相关基因Sc-A24-583基因与丝氨酸蛋白酶抑制剂具有49%的同源性。本研究利用夏颖伟硕士构建的BL21(DE3)pET-15b-Sc-A24-583重组表达菌株于25℃进行诱导表达8 h~12 h,并对所表达的Sc-A24-583重组蛋白进行功能测定。结果发现该蛋白并没有丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性,并且对昆虫寄主大蜡螟也没有毒性作用。
初生型Photorhabdus.luminescens共生细菌产生两种分子量分别为11.6 kDa和11.3 kDa的胞内晶体蛋白CipA及CipB,约占细菌总蛋白的40%。本研究测定这类蛋白是否对非昆虫病原线虫具有毒性作用。
利用游娟(2005)构建的两种蛋白的BL21(DE3)pET-15b-cipA和BL21(DE3)pET-15b-cipB重组表达菌株,于37℃下进行诱导表达4~18h,并对表达的重组蛋白复性后对海洋线虫Panagrellus redivivus进行功能测定,结果发现复性后的CipA、CipB蛋白对海洋线虫P.redivivus没有毒性作用。说明P.luminescens菌株的cipA及cipB晶体蛋白除了对昆虫病原斯氏线虫具有营养作用外(You et al.,2006),对非昆虫病原线虫的P.redivivus不具毒性作用。
以上研究结果有助于进一步研究昆虫病原线虫的发育机理及其与共生细菌的晶体蛋白的功能,推动昆虫病原线虫的产业化发展。