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ATP柠檬酸裂解酶(ACL)催化柠檬酸生成草酰乙酸(OAA)和乙酰辅酶A，是决定碳流向不同代谢物(如糖、脂肪酸、类黄酮和类异戊二烯等)生物合成途径的关键酶。尽管先前研究证实了柑橘ACL在果实成熟过程中参与了柠檬酸降解，但是其对可溶性糖、有机酸等物质的积累以及非生物因子对ACL活性的影响作用仍不清楚。本研究测定了不同柑橘品种果实发育和成熟过程中ACL活性和可溶性糖、有机酸、类黄酮等代谢物质的含量，并结合转基因试验验证ACL对相关代谢物质积累的作用；通过环境因素处理试验，明确不同环境条件对ACL活性的影响，主要结果如下：
1.ACL活性增加可能是红暗柳低积累柠檬酸和高积累一些次生代谢物的重要原因。比较了‘暗柳橙’(AL，CV/ms1cv.Anliu)和其低酸芽变品种‘红暗柳’(HAL,C.sinensiscv.Honganliu)果实汁胞之间代谢物质以及ACL基因表达和酶活性的变化，结果发现，‘HAL’果实汁胞中的柠檬酸含量显著低于‘AL’、可溶性糖和许多次生代谢物质含量则显著高于‘AL’，而ACL基因表达和酶活性均显著高于‘AL’，说明‘HAL’中ACL活性增强可能促进了柠檬酸降解、增强了糖异生途径和次生代谢物的生物合成。
2.ACL活性变化与一些代谢物质积累之间的关系存在品种差异性。系统比较了‘AL’、‘纽荷尔胳橙’(C.sinensis cv. Newhall)、‘国庆1号温州蜜柑’(C.unshiu cv.Guoqing No.1)、‘华相2号掽柑’(C. reticulata cv.Huagan No.2)、‘早香柚’(C.grandis cv.Zaoxiang)和‘HB柚’(C.grandis cv. Hirado Buntan)果实发育和成熟过程中，ACL,细胞质顺乌头酸酶(cyt-ACO)活性以及柠檬酸、类黄酮和类胡萝卜素等代谢物质含量的变化，结果表明，梓檬酸含量与ACL或cyt-ACO活性之间的关系在品种之间的差异很大，而ACL和cyt-ACO的活性显著负相关(r=-0.443)。此外，ACL活性仅与细胞质乙酰辅酶A含量之间存在显著相关性(r=0.433)。在柑橘愈伤组织中超量表达或者RNA干涉ACL表明，增加或降低ACL活性可以分别降低和诱导cyt-ACO的活性。说明ACL和cyt-ACO—起协同控制果实细胞质柠檬酸的去路，但它们不是决定柠檬酸和柑橘果实中其他代谢物积累的关键因素。
3.ACL活性差异显著可能是柑橘成熟叶片(ML)和果实汁胞(JS)代谢物质积累差异的一个重要原因。比较了7个柑橘品种ML和JS之间的ACL基因表达和酶活性、柠檬酸和细胞质乙酰辅酶A含量的差异，结果表明，7个柑橘品种ML中的ACL基因表达、酶活性和细胞质乙酰辅酶A含量均显著高于JS，而柠檬酸含量均显著低于JS。进一步以‘HB’柚为材料，全面比较了ML和JS之间的代谢产物和基因转录水平的差异，最终鉴定了227个差异代谢物(DEMs)和10040个差异表达基因(DEGs)。与JS相比，ML中的淀粉和一些属于类黄酮、脂肪酸和甘油脂类的DEMs，以及光合作用途径中的某些特定DEGs上调；而可溶性糖、柠檬酸和维生素C(Vc)下调。联合分析表明，ML和JS之间的淀粉、蔗糖、柠檬酸、类黄酮、类胡萝卜素、Vc和茉莉酸(JA)含量的差异受到其各自代谢途径中某些基因表达水平的调控。由此可见，成熟叶片高ACL活性，不仅增加了许多次生代谢物合成的中间前体物质，而且可能通过影响一些关键基因的表达来调控这些物质的合成或积累。
4.转基因研究证实ACL活性变化确实可以影响相关代谢物质的含量、以及一些基因的表达水平或酶活性。亚细胞定位分析显示CitACLs定位在细胞质和细胞核中。将超量表达或RNA干涉转化柑橘愈伤组织，发现柠檬酸含量显著增加或降低。进一步分析与梓檬酸代谢相关基因的表达水平，发现超量表达下柠檬酸的积累增加主要与ACO的表达被抑制、梓檬酸合酶(CS)的表达增强有关；ACL干涉下柠檬酸含量减少主要与的表达被诱导、的表达被抑制相关。而细胞质乙酰辅酶A作为ACL催化柠檬酸降解的中心代谢产物，在超量表达柑橘愈伤组织中，其含量显著积累；在RNA干涉柑橘愈伤组织中，其含量则显著降低。并且超量表达柑橘愈伤组织中类黄酮含量显著提高，类胡萝卜素含量显著降低；干涉柑橘愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素含量均显著降低，说明ACL对类黄酮含量的影响可能大于类胡萝卜素。另外，将超量表达转化番茄，结果表明，转基因番茄果实和叶片中柠檬酸含量均显著降低，细胞质乙酰辅酶A含量均显著增加。分析柠檬酸代谢相关内源基因的表达表明，超量表达ACL可以促进SlACOs以及SlACLs的表达，抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(SIPEPC2)的表达，因此降低了柠檬酸的积累。
5.ACL活性可以受到营养元素和环境因素的影响。(1)叶面喷施氮肥和遮光处理，显著降低了果实ACL活性，增加了柠檬酸含量，同时降低了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(2)叶面喷施磷肥或钾肥，可以增强果实ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A含量；(3)叶面喷施镁肥，可以增强果实ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(4)降低国庆1号温州蜜柑愈伤组织pH(PH4.8)，可以增强ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(5)低温(4℃)处理愈伤组织后，ACL活性增强，柠檬酸、细胞质乙酰辅酶A和类黄酮含量增加。
1.ACL活性增加可能是红暗柳低积累柠檬酸和高积累一些次生代谢物的重要原因。比较了‘暗柳橙’(AL，CV/ms1cv.Anliu)和其低酸芽变品种‘红暗柳’(HAL,C.sinensiscv.Honganliu)果实汁胞之间代谢物质以及ACL基因表达和酶活性的变化，结果发现，‘HAL’果实汁胞中的柠檬酸含量显著低于‘AL’、可溶性糖和许多次生代谢物质含量则显著高于‘AL’，而ACL基因表达和酶活性均显著高于‘AL’，说明‘HAL’中ACL活性增强可能促进了柠檬酸降解、增强了糖异生途径和次生代谢物的生物合成。
2.ACL活性变化与一些代谢物质积累之间的关系存在品种差异性。系统比较了‘AL’、‘纽荷尔胳橙’(C.sinensis cv. Newhall)、‘国庆1号温州蜜柑’(C.unshiu cv.Guoqing No.1)、‘华相2号掽柑’(C. reticulata cv.Huagan No.2)、‘早香柚’(C.grandis cv.Zaoxiang)和‘HB柚’(C.grandis cv. Hirado Buntan)果实发育和成熟过程中，ACL,细胞质顺乌头酸酶(cyt-ACO)活性以及柠檬酸、类黄酮和类胡萝卜素等代谢物质含量的变化，结果表明，梓檬酸含量与ACL或cyt-ACO活性之间的关系在品种之间的差异很大，而ACL和cyt-ACO的活性显著负相关(r=-0.443)。此外，ACL活性仅与细胞质乙酰辅酶A含量之间存在显著相关性(r=0.433)。在柑橘愈伤组织中超量表达或者RNA干涉ACL表明，增加或降低ACL活性可以分别降低和诱导cyt-ACO的活性。说明ACL和cyt-ACO—起协同控制果实细胞质柠檬酸的去路，但它们不是决定柠檬酸和柑橘果实中其他代谢物积累的关键因素。
3.ACL活性差异显著可能是柑橘成熟叶片(ML)和果实汁胞(JS)代谢物质积累差异的一个重要原因。比较了7个柑橘品种ML和JS之间的ACL基因表达和酶活性、柠檬酸和细胞质乙酰辅酶A含量的差异，结果表明，7个柑橘品种ML中的ACL基因表达、酶活性和细胞质乙酰辅酶A含量均显著高于JS，而柠檬酸含量均显著低于JS。进一步以‘HB’柚为材料，全面比较了ML和JS之间的代谢产物和基因转录水平的差异，最终鉴定了227个差异代谢物(DEMs)和10040个差异表达基因(DEGs)。与JS相比，ML中的淀粉和一些属于类黄酮、脂肪酸和甘油脂类的DEMs，以及光合作用途径中的某些特定DEGs上调；而可溶性糖、柠檬酸和维生素C(Vc)下调。联合分析表明，ML和JS之间的淀粉、蔗糖、柠檬酸、类黄酮、类胡萝卜素、Vc和茉莉酸(JA)含量的差异受到其各自代谢途径中某些基因表达水平的调控。由此可见，成熟叶片高ACL活性，不仅增加了许多次生代谢物合成的中间前体物质，而且可能通过影响一些关键基因的表达来调控这些物质的合成或积累。
4.转基因研究证实ACL活性变化确实可以影响相关代谢物质的含量、以及一些基因的表达水平或酶活性。亚细胞定位分析显示CitACLs定位在细胞质和细胞核中。将超量表达或RNA干涉转化柑橘愈伤组织，发现柠檬酸含量显著增加或降低。进一步分析与梓檬酸代谢相关基因的表达水平，发现超量表达下柠檬酸的积累增加主要与ACO的表达被抑制、梓檬酸合酶(CS)的表达增强有关；ACL干涉下柠檬酸含量减少主要与的表达被诱导、的表达被抑制相关。而细胞质乙酰辅酶A作为ACL催化柠檬酸降解的中心代谢产物，在超量表达柑橘愈伤组织中，其含量显著积累；在RNA干涉柑橘愈伤组织中，其含量则显著降低。并且超量表达柑橘愈伤组织中类黄酮含量显著提高，类胡萝卜素含量显著降低；干涉柑橘愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素含量均显著降低，说明ACL对类黄酮含量的影响可能大于类胡萝卜素。另外，将超量表达转化番茄，结果表明，转基因番茄果实和叶片中柠檬酸含量均显著降低，细胞质乙酰辅酶A含量均显著增加。分析柠檬酸代谢相关内源基因的表达表明，超量表达ACL可以促进SlACOs以及SlACLs的表达，抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(SIPEPC2)的表达，因此降低了柠檬酸的积累。
5.ACL活性可以受到营养元素和环境因素的影响。(1)叶面喷施氮肥和遮光处理，显著降低了果实ACL活性，增加了柠檬酸含量，同时降低了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(2)叶面喷施磷肥或钾肥，可以增强果实ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A含量；(3)叶面喷施镁肥，可以增强果实ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(4)降低国庆1号温州蜜柑愈伤组织pH(PH4.8)，可以增强ACL活性，降低柠檬酸含量，提高了细胞质乙酰辅酶A和类黄酮的含量；(5)低温(4℃)处理愈伤组织后，ACL活性增强，柠檬酸、细胞质乙酰辅酶A和类黄酮含量增加。