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柑橘因其为人类提供丰富的健康物质和不同风味而深受消费者喜爱。风味是果实重要的感官品质之一，也是决定果品市场性的重要因素。柑橘果实的风味主要决定于果实汁胞中的糖酸水平及它们的比例，而果实中的糖酸水平取决于可溶性糖、有机酸在果实细胞液胞中贮藏能力，其中蔗糖和柠檬酸柠檬酸分别是果实积累的重要糖分和有机酸。已有研究表明，液胞膜上存在三种质子泵，液胞型H+-ATPase(V-ATPase)、质膜型H+-ATPase(P-type V-ATPase)和液胞型H+-pyrophosphatase(V-PPase)，它们通过提供电化学梯度和能量在促进物质进入液胞贮藏中起到非常重要的作用。有些研究认为I型V-PPase基因在适应逆境或在特定组织中能够促进有机酸和花青素在液胞中积累中起到重要作用，不过它们是否在可溶性糖和柠檬酸(柑橘果实的主要风味物质)积累与液胞中起作用，目前还不清楚。本研究首先从柑橘基因组中鉴定了V-PPase基因，然后通过对不同品种和不同处理(干旱和ABA)情况下果实中的可溶性糖、柠檬酸含量和基因表达的共分析、以及转基因和V-PPase抑制剂处理等试验，验证了I型V-PPase基因在柑橘果实可溶性糖(蔗糖)和有机酸(柠檬酸)积累中的作用。同时通过比较红暗柳和暗柳和暗柳橙中可溶性糖含量及相关的基因表达水平，探讨了红暗柳低积累蔗糖的原因。主要结果如下：
1、从柑橘基因组中鉴定了3个基因，命名为CsVPP-1、CsVPP-2和CsVPP-4，其中CsVPP-1和CsVPP-2属于I型V-PPase基因，定位在液胞膜上，CsVPP-4属于II型V-PPase基因，定位在高尔基体上。基因结构分析表明，CsVPP-1和CsVPP-2有8个外显子和7个内含子、而CsVPP-4有14个外显子和13个内含子。另外，I型V-PPase基因在果实汁胞中高表达。
2、在国庆1号温州蜜柑(Citrus unshiu cv. Guoqing No.1)和尤力克柠檬(C. limonia cv. Eureka)发育过程中，CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平和蔗糖含量的变化高度一致：CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平在国庆1号果实中随着蔗糖含量积累而快速增加，在尤力克柠檬中则随着蔗糖含量的下降而下降。在另三个品种[华柑2号椪柑(C. reticulata cv. Huagan No. 2)、南丰蜜橘(C. reticulata cv. Nanfeng)和纽荷尔脐橙(C. sinensis cv. Newhall)]中的相关分析表明，CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平和蔗糖含量均呈较强的正相关关系、但是与柠檬酸的在关系在所研究品种中的相关性表现不一致。
3、以国庆1号温州蜜柑为材料，单独进行干旱和ABA处理，结果发现，两个处理都显著提高了CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平以及可溶性糖分水平，而干旱显著提高了果实中柠檬酸的含量、ABA处理对柠檬酸的影响未达到显著水平。
4、I型V-PPase基因在叶片和果实的超表达和抑制剂处理试验表明，超表达显著降低了焦磷酸含量、增加了蔗糖含量，抑制剂处理显著增加了焦磷酸含量和降低了蔗糖含量。同时，改变I型V-PPase基因的表达水平直接影响了蔗糖运输蛋白基因的表达。
5、红暗柳是暗柳橙的芽变，其蔗糖积累较少。两个品种果实发育过程中，果糖和葡萄糖含量均表现上升趋势，在花后160天后，红暗柳果实中的两种己糖含量均显著低于暗柳橙；另一方面，红暗柳果实的蔗糖含量随着果实发育而表现下降趋势、而暗柳橙果实的蔗糖含量则随着果实发育而表现上升趋势。糖分积累相关基因表达分析表明，在花后100天或160天之后，红暗柳中的VINV、CWINV1、CWINV2、SUS4、SUS5、SPS1、SPS2、VPP-1、VPP-2和一些糖分运输蛋白基因的表达水平均显著低于暗柳橙，其中SPS2和SUT2的表达水平变化与两个品种果实中蔗糖含量变化趋势一致。
综合来看，I型V-PPase基因至少通过调控焦磷酸动态平衡和糖分运输过程在柑橘果实液胞中蔗糖积累起到关键作用；同时I型V-PPase基因在干旱逆境下对糖分和柠檬酸调控起重要作用。对比红暗柳和暗柳橙果实发育过程中糖分积累以及相关基因的表达差异，推测I型V-PPase基因的低表达可能是红暗柳低积累蔗糖的重要原因之一。
1、从柑橘基因组中鉴定了3个基因，命名为CsVPP-1、CsVPP-2和CsVPP-4，其中CsVPP-1和CsVPP-2属于I型V-PPase基因，定位在液胞膜上，CsVPP-4属于II型V-PPase基因，定位在高尔基体上。基因结构分析表明，CsVPP-1和CsVPP-2有8个外显子和7个内含子、而CsVPP-4有14个外显子和13个内含子。另外，I型V-PPase基因在果实汁胞中高表达。
2、在国庆1号温州蜜柑(Citrus unshiu cv. Guoqing No.1)和尤力克柠檬(C. limonia cv. Eureka)发育过程中，CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平和蔗糖含量的变化高度一致：CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平在国庆1号果实中随着蔗糖含量积累而快速增加，在尤力克柠檬中则随着蔗糖含量的下降而下降。在另三个品种[华柑2号椪柑(C. reticulata cv. Huagan No. 2)、南丰蜜橘(C. reticulata cv. Nanfeng)和纽荷尔脐橙(C. sinensis cv. Newhall)]中的相关分析表明，CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平和蔗糖含量均呈较强的正相关关系、但是与柠檬酸的在关系在所研究品种中的相关性表现不一致。
3、以国庆1号温州蜜柑为材料，单独进行干旱和ABA处理，结果发现，两个处理都显著提高了CsVPP-1和CsVPP-2的表达水平以及可溶性糖分水平，而干旱显著提高了果实中柠檬酸的含量、ABA处理对柠檬酸的影响未达到显著水平。
4、I型V-PPase基因在叶片和果实的超表达和抑制剂处理试验表明，超表达显著降低了焦磷酸含量、增加了蔗糖含量，抑制剂处理显著增加了焦磷酸含量和降低了蔗糖含量。同时，改变I型V-PPase基因的表达水平直接影响了蔗糖运输蛋白基因的表达。
5、红暗柳是暗柳橙的芽变，其蔗糖积累较少。两个品种果实发育过程中，果糖和葡萄糖含量均表现上升趋势，在花后160天后，红暗柳果实中的两种己糖含量均显著低于暗柳橙；另一方面，红暗柳果实的蔗糖含量随着果实发育而表现下降趋势、而暗柳橙果实的蔗糖含量则随着果实发育而表现上升趋势。糖分积累相关基因表达分析表明，在花后100天或160天之后，红暗柳中的VINV、CWINV1、CWINV2、SUS4、SUS5、SPS1、SPS2、VPP-1、VPP-2和一些糖分运输蛋白基因的表达水平均显著低于暗柳橙，其中SPS2和SUT2的表达水平变化与两个品种果实中蔗糖含量变化趋势一致。
综合来看，I型V-PPase基因至少通过调控焦磷酸动态平衡和糖分运输过程在柑橘果实液胞中蔗糖积累起到关键作用；同时I型V-PPase基因在干旱逆境下对糖分和柠檬酸调控起重要作用。对比红暗柳和暗柳橙果实发育过程中糖分积累以及相关基因的表达差异，推测I型V-PPase基因的低表达可能是红暗柳低积累蔗糖的重要原因之一。