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洋底沉积物是地球上最大的碳汇,并在海洋、大气化学以及全球气候变化中发挥重要作用。大量的研究证明洋底沉积物拥有最多的原核微生物类群和数量,虽然近年来有关洋底深部沉积物真菌类群的研究逐渐增多,但研究深度有限(<1626mbsf, meters below seafloor),尚未涉及更深真菌类分布和其营养源及功能的研究。该研究基于大洋钻探计划(International Ocean Discovery Program,IODP)337航次获得的深度达1924mbsf的太平洋洋底煤层样品(C0020A-15R-5),开展了洋底沉积物可培养真菌的分离鉴定及其降解煤炭能力的研究,取得了如下主要结果。 采用模拟原位离子浓度,适当添加营养元素的分离培养基IM,在厌氧条件下,从岩芯样品C0020A-15R-5中分离到一株白色丝状真菌,菌株编号15R-5-F01。根据菌丝形态和孢子显微观察、核糖体RNA序列分析结果,该菌株鉴定为担子菌门(Basidiomycota)、伞菌目(Agaricales)、裂褶菌科(Schizophyllaceae)、裂褶菌属(Schizophyllum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)。 以陆地来源的裂褶菌CFCC7252和海洋来源的裂褶菌MCCC3A00233为对照,研究了裂褶菌15R-5-F01在不同培养条件下的生长特性,证明该菌生长最适温度为30℃、pH为7、盐度为2.92%,更适宜在厌氧环境下生长。其生长特性与陆地来源菌株CFCC7252接近,而与海洋来源菌株MCCC3A00233较远。结合ITS序列分析,推测洋底沉积物裂褶菌来源于陆地,并随植物一同沉积。 采用平板培养法,将煤粉直接撒在长满菌丝的纯化培养基(PM)平板上厌氧培养3天发现,褐煤煤粉液化为黑色液滴。在400倍光学显微镜下,裂褶菌15R-5-F01菌丝对褐煤有明显的吸附作用,表明该菌有潜在降解褐煤的能力。 采用摇瓶培养法培养20天,研究了裂褶菌15R-5-F01在不同条件下降解新疆褐煤的能力。发现葡萄糖和氧气对该菌降解褐煤没有显著性影响,降解率都达到15%。生物量除不加葡萄糖厌氧培养较低(0.01g),其他处理都达到0.15g。 利用扫描电镜(SEM)观察、元素分析、傅里叶变换红外光谱分析等技术,研究了裂褶菌15R-5-F01降解褐煤过程中褐煤表面结构的变化,发现该菌与褐煤相互接触,通过氧化作用使煤表面元素C和H含量分别下降1.68%-3.31%和0.64%-0.69%,具有芳香环结构(680-800 cm-1)的物质减少。对该菌降解褐煤中间产物的GC-MS分析,发现主要为2,3-二氢-9,10-二羟基1,4-蒽醌、n-棕榈酸、2,6-二甲基苯甲醛等。对该菌降解褐煤终产物的GC分析,发现有CH4(1.48mg/m3)的生成。这些实验结果表明,在厌氧条件下,裂褶菌15R-5-F01可以完全矿化褐煤,形成甲烷。 比较了在好氧与厌氧条件下裂褶菌15R-5-F01降解褐煤的差异,发现在好氧条件下,褐煤表面C元素含量降低较高(3.31%),自由羟基(3650cm-1)增多,降解中间产物较少(3种),而在厌氧条件下,C元素含量下降较少(1.68%),表面羟基(3200-3500cm-1)减少,降解中间产物较多(10种)。表明裂褶菌15R-5-F01降解褐煤在好氧和厌氧条件下可能具有不同的降解机制。 采用与降解褐煤相同的研究方法,测定了裂褶菌15R-5-F01降解高阶皖南烟煤的能力,发现该菌对烟煤也有一定的作用:葡萄糖和氧气对皖南烟煤降解率影响不显著,降解率为6.5%-9.0%,而葡萄糖对降解烟煤过程中生物量有较大影响,在不添加葡萄糖的处理组,其生物量(0.01g)显著低于添加葡萄糖处理组(0.08-0.12g)。元素分析发现,烟煤降解后C、H元素含量分别下降0.67%-1.45%和0.13%-0.25%;红外分析得知,烟煤羟基类结构(3200-3500cm-1)增多。 通过对裂褶菌15R-5-F01降解褐煤和烟煤实验中锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)的测定,证明该菌降解褐煤主要依赖于MnP和Lip,煤炭可显著诱导这两种酶的酶活,而Lac酶活很低(<1U/L)。培养基中添加葡萄糖对该菌MnP、Lip和Lac酶活没有显著影响,表明裂褶菌15R-5-F01采用非共代谢途径降解煤。 创新性:(1)发现洋底1924mbsf深煤层中有真菌的分布,这也是目前报道的洋底沉积物真菌分布的最深记录。(2)发现裂褶菌分布于洋底沉积物,且其可能来源于陆地。(3)发现裂褶菌15R-5-F01具有很高的褐煤降解活性,并可降解更高阶的烟煤。 基于上述研究结果,我们认为真菌是深部生物圈的重要组成部分,在洋底沉积物环境的碳循环中扮演重要角色。