论文部分内容阅读
微拟球藻属的种类光合作用效率高、生长较快、油含量高、易于大规模培养，被认为是最有潜力的工业产油的模式研究藻种。该属大多数种类的基因组序列已经公布，且已建立成熟的遗传转化体系和RNA干扰、重源重组、CRISPR/Cas9等基因编辑技术。磷脂∶二酰甘油酰基转移酶(PDAT)催化以磷脂为酰基供体，二酰甘油(DAG)为酰基受体，合成三酰甘油(TAG)的反应。体外实验显示，多种类型的磷脂均可以作为酰基供体，它还是一个多功能酶，具有降解包括TAG在内的多种脂类物质的脂肪酶活性。然而，PDAT在体内对底物的特异性及对其他脂类代谢的调控尚不清楚。本文以海洋微拟球藻PDAT(nPDAT)基因为对象，利用过量表达、RNA干扰等遗传操作手段，通过亚细胞定位、生长、脂质组和转录组等分析，详细阐述了nPDAT的底物专一性、对TAG及极性脂代谢的调控机理。研究结果如下: 1.在野生型海洋微拟球藻中过量表达nPDAT,随机挑选8个转化子，选取2个nPDAT在转录和蛋白质水平均显著上调的转基因株用于实验。通空气培养时，nPDAT过量表达导致藻细胞TAG含量增加17～50％，过量表达藻株生长及总脂含量与野生型相当，相应地极性脂含量减少。脂肪酸组成分析显示过量表达藻株TAG的C20∶4增加。根据nPDAT与eGFP融合蛋白质在海洋微拟球藻及异源的三角褐指藻细胞内的荧光信号，显示nPDAT定位于叶绿体内质网膜(cER)。这些结果暗示，过量表达nPDAT促进细胞利用含C20∶4脂酰基的磷脂为主合成TAG。 2.通过RNA干扰技术对nPDAT进行敲降，随机挑选10个转化子，选取2个nPDAT在转录水平分别下调33％和64％的突变株npdat-2和npdat-4用于实验。通空气培养时，nPDAT的下调导致TAG含量减少19～34％，突变株生长及总脂含量不变，但总极性脂含量增加。尤其是磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)含量在突变株中显著增加，磷脂酰胆碱(PC)也有增加的趋势。PG随着培养时间延长，逐渐减少，而PE则显示出增加的趋势。特别地，突变株中含短链脂酰基(＜C20)的磷脂酰乙醇胺(scPE)在细胞内大量积累，而含长链不饱和脂酰基(＞C18)的磷脂酰乙醇胺(lcPE)则减少。脂肪酸分析显示，突变株中总脂的C16∶0和C16∶1含量增加，而C20∶4和C20∶5含量显著减少;突变株中TAG的脂肪酸相对组成几乎与野生型相同。基于这些结果及野生型海洋微拟球藻PG（脂酰基链以C16∶0、C16∶1、C20∶4和C20∶5为主）和PE（脂酰基链以C20∶4和C20∶5为主）的脂肪酸组成特性，nPDAT在体内可能主要以PG为底物合成TAG，而对PG的专一性也与nPDAT的定位相吻合。 3.转录组分析显示，nPDAT敲降导致CDP乙醇胺∶DAG乙醇胺磷酸转移酶(EPT)剧烈上调，脂肪酸从头合成相关酶、脂肪酸延长酶表达下调，主要的二酰甘油酰基转移酶(DGAT)表达不变或下调。因而，nPDAT敲降导致其底物PG和DAG积累，累积的DAG经EPT催化形成scPE，而新合成的scPE的脂酰链不能进一步编辑形成长链的脂酰基。 4.由于nPDAT过量表达可以提高藻细胞TAG含量且对生长没有影响，为进一步扩展它的应用，我们在另一模式产油微藻三角褐指藻中过量表达nPDAT,检测其对油脂积累的影响。将nPDAT分别转入野生型三角褐指藻和3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(HIBCH)过量表达的三角褐指藻（HIBCH过量表达导致异亮氨酸分解的碳流快速流向三羧酸循环，从而导致油脂合成增加）中，结果显示，在三角褐指藻中过量表达nPDAT可促进TAG积累，并导致TAG中C20∶5的相对含量显著增加，这为我们利用基因工程手段促进多不饱和脂肪酸流向TAG提供了新的思路。