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肠球菌是一类球形或卵圆形，过氧化氢酶阴性，不形成芽孢，经常以单个、成对或链状排列的需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，其作为正常菌群主要存在于人和动物体胃肠道，也广泛分布于土壤、水等环境中，其中粪肠球菌和屎肠球菌是优势菌种。早期肠球菌主要被当作抑菌剂、发酵剂和益生元而应用到食品或饲料中，但随着其对抗生素的耐药性被大家所认识，肠球菌对人和动物的致病性越来越受到人们的重视。肠球菌主要通过黏附、侵袭和组织损伤而使人和动物体感染致病，黏附是感染的第一步也是最为重要的一步，只有黏附到细胞或细胞外基质上才能侵入机体最终导致组织损伤。在肠球菌许多的毒力因子中，粪肠球菌胶原蛋白黏附素Ace在肠球菌早期感染中显的尤为重要。本试验通过对Ace的研究，以期为今后肠球菌病的快速诊断及研制有效的疫苗提供详实的参考数据，以保证动物性食品的质量与安全。根据GenBank公布的肠球菌Ace基因序列A片段设计粪肠球菌胶原蛋白黏附素特异性引物，以猪源肠球菌DNA为模板，通过PCR扩增出813bp目的基因，纯化后的PCR产物与克隆载体pTG19-T连接，转化入克隆菌体DH5α，经质粒PCR、酶切和测序鉴定重组质粒构建成功。然后对本实验室保存的3株标准菌和43株分离致病菌进行Ace扩增，3株全部含有Ace基因，43株中有30株携带有这个基因，携带率为71.7%，携带率较高，同时对46株菌进行同源性比对，同源率在98.0%～100.0%，与研究的同源性≥97.5%相符。说明Ace广泛存在于肠球菌中，且高度保守，所以可针对此蛋白进行肠球菌的检测与防治。PCR产物与表达载体pET-32a连接后转化入表达菌体BL21中，经质粒PCR、酶切和测序鉴定重组质粒构建成功。终浓度为0.8mmol/L的IPTG37℃诱导菌体6h后，原核表达出可溶性蛋白，以此蛋白免疫兔制得的高免血清作为一抗，经Western blot鉴定，Ace蛋白具有很好的免疫活性。黏附试验中，肠球菌分别于37℃和46℃下培养，与不同浓度的阳、阴性血清作用后黏附IPEC-J2细胞。结果表明，37℃和46℃下都能够表达Ace，但46℃时表达量较高，抗Ace的血清能够阻止肠球菌对IPEC-J2细胞的黏附。以粪肠球菌胶原蛋白Ace为包被蛋白，Ace免疫家兔制得的高免血清作为阳性血清，经一系列条件优化后，建立了检测肠球菌抗体的间接ELISA方法。优化条件为Ace包被含量1μg/mL，一抗的最佳稀释度为1:800，包被条件为37℃静置2h再放于4℃过夜，封闭液以1%BSA为佳，封闭时间为2h，血清的最佳反应时间为1h，酶标二抗的最佳稀释度为1:600，最佳反应时间也是1h，与底物的作用时间15min最佳，临界值OD为0.082，当P/N≥2.1且OD≥0.082可判定为阳性。特异性和重复性试验表明，所建立的间接ELISA方法能够有效检测出阳、阴性血清，可用于肠球菌病的活体检测。