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目的：人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是引发宫颈癌及癌前病变的主要危险因素。90％以上的宫颈癌患者曾感染过HPV，其中超过60％的感染是HPV16型。HPV16主要衣壳蛋白(L1蛋白)结构保守，含多个抗原表位，且均属于中和表位，因此常常被作为靶抗原进行研究。
本研究拟建立能稳定分泌高亲和力、高特异性的HPV16 L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对其亲和力、特异性及生物学活性进行鉴定的基础上，扩增单抗的轻、重链可变区基因，并分析其序列，以期构建基因工程抗体，建立快速检测HPV感染的免疫学方法，为影响宫颈癌及癌前病变高危因素的早期干预奠定基础。同时为研究HPV16 L1抗原决定簇、HPV蛋白组学及发病机制提供条件。
方法：(1)基因工程菌pQE31-HPV16 L1/M15(pREP4)用IPTG诱导表达，Ni-NTA纯化柱纯化HPV16 L1蛋白。(2)以HPV16 L1蛋白为免疫原，经杂交瘤技术，用HAT选择培养液筛选融合的细胞，间接ELISA法筛选抗体分泌阳性细胞，经亚克隆培养后，建立分泌抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)间接ELISA法检测腹水型单抗的效价，双向琼脂扩散试验鉴定抗体亚类，非竞争酶免疫试验测定相对亲和力，Western blot法鉴定特异性，并采用血凝抑制试验、免疫荧光、免疫组化和免疫电镜等方法研究单克隆抗体的生物学活性。(4)采用5-RACE策略扩增单抗的轻、重链可变区基因。利用BLAST、IgBLAST等软件进行分析比对。(5)利用同源模建方法预测单抗可变区的三维结构。
结果：(1)重组工程菌pQE31-HPV16 L1/M15(pREP4)经IPTG诱导后表达出Mr 57000的蛋白，经Westem blot证明确为特异目的HPVl6 L1蛋白。(2)建立了二株能稳定分泌抗HPV16L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，AE3株和AG7株。杂交瘤细胞所分泌的AE3单抗和AG7单抗效价为1：5120和1：80。(3)腹水型AE3单抗和AG7单抗的效价分别为1：10<6>和1：10<4>。二者均为IgG1亚类。经Western blot证实，二株单抗只与HPV16 L1蛋白特异反应，与 HPV16 E6、E7蛋白均无交叉反应。AE3单抗和AG7单抗均具有血凝抑制活性。从相对亲和力来看，AE3单抗的亲和力高于AG7单抗。二株单抗可以识别真核细胞Sf9中HPV16 L1 VLP，说明二株抗体是立体构象依赖性的。(4)AE3和AG7可变区序列分析结果表明：①与Genebank中鼠抗体VL序列进行同源性分析，AE3单抗为87.9％～98.5％，AG7单抗为80.9％～97.2％；与Genebank中鼠抗体VH序列进行同源性分析，AE3单抗为78.1％～97.4％，AG7单抗为82.1％～98％，二株单抗的轻、重链可变区序列均为新的基因。②二株单抗的VL基因均为336bp，编码112个氨基酸；VH基因均为354bp，编码118个氨基酸。有明确的4个框架区(FR)和3个抗原互补决定区(CDR)。均符合小鼠Ig可变区序列特征。③比较二株单抗VL序列的差异，核苷酸差异率为CDR1区29.2％、CDR2区42.9％、CDR3区48.1％；氨基酸差异率为CDR.1区50％、CDR2区57.1％、CDR3区66.7％，CDR2和CDR3区差异率较高。④比较二株单抗VH序列的差异，核苷酸差异率为CDR1区46.7％、CDR2区27.5％、CDR3区77.8％；氨基酸差异率为CDR1区100％、CDR2区47.1％、CDR3区77.8％，CDR1和CDR3区相对高一些。(5)用同源模建法预测出二株单抗的三维结构。结论：成功建立了二株能稳定分泌高亲和力、高特异性抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即AE3株和AG7株。AE3单抗的效价、亲和力等生物学活性均优于AG7单抗。杂交瘤细胞扩增出抗体轻、重链可变区基因，均属于新的抗体可变区基因，基因序列符合小鼠Ig可变区序列特征。AG7单抗的可变区序列与AE3相比，核苷酸及氨基酸序列都有较高的差异率，主要集中于三个CDR区，可见本试验制备的二株单抗所识别的抗原决定簇是不同的。而且基因序列的差异也决定了二者生物学活性的不同。成功预测了二株单抗的三维空间结构，为基因工程抗体的制备、建立HPV感染检测试剂盒奠定了基础。