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乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的，可能危及生命的肝脏感染性疾病。HBV可引起急性和慢性感染，是导致严重肝病如肝硬化（Liver Cirrhosis，LC）和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）的主要原因。乙肝病毒对全球公共卫生及人类的健康影响是巨大的，据估计全球有20亿人感染或曾今感染过乙肝病毒，以及3.6亿隐匿或慢性感染乙肝病毒。
乙肝的感染类型主要分为急性乙肝和慢性乙肝。其中慢性乙肝又可分为：慢性乙肝感染、慢性乙肝病毒携带者、非活动性表面抗原携带者等。由于慢性乙肝占据了乙肝感染大部分比例，因此对于慢性乙肝感染的诊断尤为重要。而对于慢性乙肝感染的诊断主要基于两个方面，一是HBV血清学标志物，例如“乙肝两对半”，其中包含：乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HbsAg）、乙肝病毒表面抗体（Hepatitis B surface antibody，HbsAb）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B virus e antigen，HbeAg）、乙肝病毒e抗体（Hepatitis B virus e antibody，HbeAb）、乙肝病毒核心抗体（Hepatitis B virus core antibody，HbcAb）；二是HBV DNA定量，即病毒滴度。根据《乙肝防治指南》（2015版）中说明，外周血中HBV DNA含量高于500copies/mL即可判定为乙肝病毒阳性，而高于1000copies/mL则是病毒在体内复制活跃的标志。HBV DNA血清学水平的测量对于乙肝的诊断、乙肝感染阶段的确定，治疗方案的选择以及患者的随访至关重要。目前对HBV DNA定量的方法多种多样，主要是基于PCR技术的各种方法，如实时荧光定量PCR（包括TaqMan、SYBR Green）和数字PCR等。
现对慢性乙肝患者的治疗方法主要分为两种：一种是干扰素（INF-α），第二种是核苷类药物（NAs），如恩替卡韦（EVT）、替诺福韦酯（TDF）、拉米夫定（LAM）、替比夫定（LdT）等。然而，在慢性乙肝患者进行治疗的过程中，患者体内的病毒株会对抗病毒药物产生耐药。耐药的产生的机制主要有两种：一种是由于服药过程中HBV DNA逆转录酶区的相关碱基突变，突变的病毒株对药物不在敏感从而重新活跃；第二种是患者初次感染后体内即存在野生株和突变株病毒，药物的使用抑制了原本占优势地位的野生株从而使突变株复制活跃。
在患者服用抗病毒药物治疗过程中，监测相关耐药位点的突变情况，对临床上治疗方案的选择有重要的意义。目前，对耐药突变检测的方法主要有PCR产物直接测序及克隆测序、RELP/RFMP、线性探针反向杂交法（INNO liPA）、Microarray等。其中PCR产物直接测序由于其成本较低、操作简便等优点被广泛应用于临床，但该方法检测突变的最低限度是20%，对于耐药早期一些低比例的突变难以检测。将PCR产物克隆后测序可以检测低至5%比例的突变，但是克隆步骤繁琐且时间周期较长，无法应用于临床。
由此可见，当前临床上与乙肝相关的两个重要实验室指标，即HBV DNA滴度和耐药位点突变是分别检测的，且各自的检测方法都有不足。如real-time PCR定量HBV DNA存在非特异性扩增以及不同试剂盒灵敏度差异较大等缺点；耐药位点检测运用最广的PCR产物直接测序也存在对低比例的突变无法检测、不易自动化等问题。
目的：
本研究，在核酸飞行时间质谱平台上将rcPCR和Multi-PLEX相结合，设计灵敏度高、特异性强、便于临床设计和操作，且同时具备病毒载量和耐药突变位点的检测平台。
方法：
1.通过对已发表的文献中对病毒滴度定量区域进行汇总，同时通过数据库（NCBI）查找不同基因型HBV DNA序列，利用MEGA7软件分析序列的同源性，在逆转录酶区域找到同源性较高的一段，分别设计①扩增定量PCR引物及延伸引物；②耐药突变检测区域PCR引物和延伸引物。
2.构建野生型质粒和各耐药位点的突变型质粒。
3.于温州医科大学第一附属医院感染科和消化内科收集乙肝患者血清样本，-80℃保存。并且记录患者详细临床信息。
4.挑选部分样本作为训练组，对设计的扩增引物及质谱延伸引物进行测试和优化。最后用验证组样本测试方法的敏感性和特异性等。
结果：
1.共收集155位接受核苷类抗病毒药物治疗患者的血清样本，并记录了详细的临床信息。
2.在HBV DNA逆转录区域成功设计多对引物并选择筛选出一对引物，通过rcPCR和质谱检测其敏感性和特异性均较好，可以用于HBV DNA定量检测。
3.利用反向PCR及克隆技术构建成功野生型质粒及15个耐药位点的突变型质粒，突变位点经过一代测序验证均正确，可以用于后续的实验。
4.筛选出18位患者进行耐药位点突变质谱检测，结果有4位患者发现不同的耐药突变产生，其中有3位患者同时接受了一代测序的方法检测相关突变，有1位患者两种方法检测结果一致，有2位患者质谱检测到其他的突变。
乙肝的感染类型主要分为急性乙肝和慢性乙肝。其中慢性乙肝又可分为：慢性乙肝感染、慢性乙肝病毒携带者、非活动性表面抗原携带者等。由于慢性乙肝占据了乙肝感染大部分比例，因此对于慢性乙肝感染的诊断尤为重要。而对于慢性乙肝感染的诊断主要基于两个方面，一是HBV血清学标志物，例如“乙肝两对半”，其中包含：乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HbsAg）、乙肝病毒表面抗体（Hepatitis B surface antibody，HbsAb）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B virus e antigen，HbeAg）、乙肝病毒e抗体（Hepatitis B virus e antibody，HbeAb）、乙肝病毒核心抗体（Hepatitis B virus core antibody，HbcAb）；二是HBV DNA定量，即病毒滴度。根据《乙肝防治指南》（2015版）中说明，外周血中HBV DNA含量高于500copies/mL即可判定为乙肝病毒阳性，而高于1000copies/mL则是病毒在体内复制活跃的标志。HBV DNA血清学水平的测量对于乙肝的诊断、乙肝感染阶段的确定，治疗方案的选择以及患者的随访至关重要。目前对HBV DNA定量的方法多种多样，主要是基于PCR技术的各种方法，如实时荧光定量PCR（包括TaqMan、SYBR Green）和数字PCR等。
现对慢性乙肝患者的治疗方法主要分为两种：一种是干扰素（INF-α），第二种是核苷类药物（NAs），如恩替卡韦（EVT）、替诺福韦酯（TDF）、拉米夫定（LAM）、替比夫定（LdT）等。然而，在慢性乙肝患者进行治疗的过程中，患者体内的病毒株会对抗病毒药物产生耐药。耐药的产生的机制主要有两种：一种是由于服药过程中HBV DNA逆转录酶区的相关碱基突变，突变的病毒株对药物不在敏感从而重新活跃；第二种是患者初次感染后体内即存在野生株和突变株病毒，药物的使用抑制了原本占优势地位的野生株从而使突变株复制活跃。
在患者服用抗病毒药物治疗过程中，监测相关耐药位点的突变情况，对临床上治疗方案的选择有重要的意义。目前，对耐药突变检测的方法主要有PCR产物直接测序及克隆测序、RELP/RFMP、线性探针反向杂交法（INNO liPA）、Microarray等。其中PCR产物直接测序由于其成本较低、操作简便等优点被广泛应用于临床，但该方法检测突变的最低限度是20%，对于耐药早期一些低比例的突变难以检测。将PCR产物克隆后测序可以检测低至5%比例的突变，但是克隆步骤繁琐且时间周期较长，无法应用于临床。
由此可见，当前临床上与乙肝相关的两个重要实验室指标，即HBV DNA滴度和耐药位点突变是分别检测的，且各自的检测方法都有不足。如real-time PCR定量HBV DNA存在非特异性扩增以及不同试剂盒灵敏度差异较大等缺点；耐药位点检测运用最广的PCR产物直接测序也存在对低比例的突变无法检测、不易自动化等问题。
目的：
本研究，在核酸飞行时间质谱平台上将rcPCR和Multi-PLEX相结合，设计灵敏度高、特异性强、便于临床设计和操作，且同时具备病毒载量和耐药突变位点的检测平台。
方法：
1.通过对已发表的文献中对病毒滴度定量区域进行汇总，同时通过数据库（NCBI）查找不同基因型HBV DNA序列，利用MEGA7软件分析序列的同源性，在逆转录酶区域找到同源性较高的一段，分别设计①扩增定量PCR引物及延伸引物；②耐药突变检测区域PCR引物和延伸引物。
2.构建野生型质粒和各耐药位点的突变型质粒。
3.于温州医科大学第一附属医院感染科和消化内科收集乙肝患者血清样本，-80℃保存。并且记录患者详细临床信息。
4.挑选部分样本作为训练组，对设计的扩增引物及质谱延伸引物进行测试和优化。最后用验证组样本测试方法的敏感性和特异性等。
结果：
1.共收集155位接受核苷类抗病毒药物治疗患者的血清样本，并记录了详细的临床信息。
2.在HBV DNA逆转录区域成功设计多对引物并选择筛选出一对引物，通过rcPCR和质谱检测其敏感性和特异性均较好，可以用于HBV DNA定量检测。
3.利用反向PCR及克隆技术构建成功野生型质粒及15个耐药位点的突变型质粒，突变位点经过一代测序验证均正确，可以用于后续的实验。
4.筛选出18位患者进行耐药位点突变质谱检测，结果有4位患者发现不同的耐药突变产生，其中有3位患者同时接受了一代测序的方法检测相关突变，有1位患者两种方法检测结果一致，有2位患者质谱检测到其他的突变。