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【目的】
1.验证miR-17-5p在非小细胞肺癌A549细胞系中对吉西他滨的敏感株(A549/G-)与耐药株(A549/G+)的差异表达是否与外泌体芯片结果相符。
2.在A549/G+细胞和A549/G-细胞中，分析miR-17-5p表达水平对细胞增殖能力的影响。
3.研究miR-17-5p靶基因与A549/G+细胞耐药的关系。
4.研究靶基因在A549/G+细胞中可能涉及的耐药通路。
5.探讨miR-17-5p在A549/G+细胞中可能涉及的其他耐药通路。
【方法】
1.在A549/G+细胞和A549/G-细胞中分别转染miR-17-5pmimics和miR-17-5pinhibitor，进行CCK8细胞毒性实验和克隆形成实验，分析两种细胞对吉西他滨的IC50、耐药程度、细胞存活率和克隆形成度。
2.采用Trizol法提取miR-17-5pmimics组，NC组，17-5pinhibitor组，NC组的总RNA，对样本进行mRNA水平的qPCR实验。
3.在A549/G+细胞中转染miR-7-5pmimics和A549/G-细胞中转染miR-17-5pinhibitor，进行流式细胞周期实验；通过WesternBlotting实验测定RRM2、P21、PTEN、PI3K及CCNE1等相关蛋白的表达。
4.根据外泌体基因芯片结果和在线生物信息预测软件如TargetScan，miRDB等数据库，对miR-17-5p的靶基因进行预测，选择的原则是该基因具有物种保守性。
5.针对RRM2与miR-17-5p的结合位点设计基因片段，选取含有双萤光素酶的质粒pmirGLO，构建RRM2野生型WT和RRM2突变型MUT的载体，采用双萤光素酶实验进行靶基因的验证实验。
6.在A549/G+细胞中转染RRM2siRNA，干扰RRM2表达，通过CCK8细胞毒性实验来检测对细胞的IC50及细胞存活率的影响；采用克隆形成实验检测对细胞克隆斑形成能力的影响；进行流式细胞周期实验检测对细胞周期的影响；通过WesternBlotting实验检测对PTEN、P-AKT(Ser)、P21和CCNE1等蛋白的影响。
7.提取A549/G-细胞和A549/G+细胞的胞质与胞核蛋白，并在A549/G+细胞中转染P21siRNA，通过WesternBlotting实验检测胞质与胞核蛋白中P21的表达，及P21表达被抑制后，其对P21、PTEN、PI3K及CCNE1等相关蛋白的影响。
【结果】
1.在CCK8细胞毒性实验、克隆形成实验中，与对照组相比，实验组中miR-17-5p过表达使A549/G+细胞IC50值下降(P＜0.001)，细胞克隆斑形成数目降低(P＜0.05)，细胞增殖能力下降；抑制miR-17-5p表达使A549/G-细胞IC50值升高(P＜0.05)，细胞克隆斑形成数目增多(P＜0.05)，细胞增殖能力提高。这表明miR-17-5p过表达可降低A549/G+细胞对吉西他滨的耐药性，使细胞变敏感；抑制miR-17-5p表达可提高A549/G-细胞对吉西他滨的耐药性，使细胞变得更耐药。
2.在流式细胞周期实验中，与对照组比较，实验组miR-17-5p的过表达使A549/G+细胞周期的S期比例降低，G1期比例增高(P＜0.05)，同时WesternBlotting实验发现，细胞周期相关蛋白RRM2、P21、CCNE1及CCNA2表达均降低(P＜0.01)；抑制miR-17-5p的表达使A549/G-细胞周期的S期比例增高，G1期比例降低(P＜0.01)，同时WesternBlotting实验发现，细胞周期相关蛋白RRM2、P21、CCNE1及CCNA2均表达升高(P＜0.01)。
3.芯片及生物信息学预测RRM2是miR-17-5p的靶基因；双萤光素酶实验结果发现只有RRM2WT和miR-17-5pmimics组的萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶荧光强度比值较低(P＜0.01)，其他各组比值相差不多且均无统计学意义。
4.在CCK8细胞毒性实验、克隆形成实验中，与对照组比较，实验组A549/G+细胞IC50值下降(P＜0.001)，细胞克隆斑形成数目降低(P<0.05)，细胞增殖能力下降，同时WesternBlotting实验结果表明细胞周期相关蛋白P21、CCNE1、CCNA2表达均降低。
5.在流式细胞周期实验中，与对照组比较，RRM2siRNA可使实验组A549/G+细胞周期中S期比例降低，G1期比例增高(P＜0.05)。
6.在WesternBlotting实验中，A549/G+细胞与A549/G-细胞相比，PI3K和PTEN蛋白在A549/G+细胞中表达较高(P＜0.05)，而P-PTEN蛋白则表达较低(P＜0.01)；与对照组比较，miR-17-5p过表达使实验组P-PTEN蛋白表达升高(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白表达降低(P＜0.001)，PI3K和PTEN蛋白无差异；抑制miR-17-5p的表达，使P-PTEN蛋白表达降低(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白表达升高(P＜0.01)，PI3K和PTEN蛋白显差异。
7.WesternBlotting实验检测结果显示，与A549/G-胞质组比较，A549/G+胞质组P21蛋白表达增高(P<＜0.01)；对A549/G+细胞转染RRM2siRNA和P21siRNA后，实验组与对照组相比，RRM2siRNA组中P21、CCNE1、CCNA2蛋白表达水平均降低(P＜0.01)，P-PTEN蛋白表达升高(P＜0.001)，PI3K和P-AKT(Ser)蛋白表达无差异；P21siRNA组中CCNE1、CCNA2蛋白表达均降低(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白降低(P＜0.01)，RRM2蛋白表达升高(P＜0.01)，PI3K和PTEN蛋白无差异。
【结论】
1.在A549/G+细胞中，RRM2是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p过表达或抑制RRM2表达均可降低A549/G+细胞对吉西他滨的耐药性，这可能是通过使A549/G+细胞阻滞在G1期，无法顺利进入S期这一过程实现的；同理，在A549/G-细胞中，抑制miR-17-5p的表达水平，则可提高A549/G-细胞对吉西他滨的耐药性。
2.在A549/G+细胞中，P21可能是RRM2的下游基因，且与RRM2形成负反馈机制，CCNA2与CCNE1可能是P21的下游基因，这些基因共同构成了由miR-17-5p介导的A549/G+细胞的耐药机制的一部分。
3.在A549/G+细胞中，很有可能存在由P-PTEN缺失而激活的PI3K/AKT通路，且miR-17-5p上调或RRM2下调均可使P-PTEN蛋白增多，以此增强A549/G+细胞对吉西他滨的敏感性。。
1.验证miR-17-5p在非小细胞肺癌A549细胞系中对吉西他滨的敏感株(A549/G-)与耐药株(A549/G+)的差异表达是否与外泌体芯片结果相符。
2.在A549/G+细胞和A549/G-细胞中，分析miR-17-5p表达水平对细胞增殖能力的影响。
3.研究miR-17-5p靶基因与A549/G+细胞耐药的关系。
4.研究靶基因在A549/G+细胞中可能涉及的耐药通路。
5.探讨miR-17-5p在A549/G+细胞中可能涉及的其他耐药通路。
【方法】
1.在A549/G+细胞和A549/G-细胞中分别转染miR-17-5pmimics和miR-17-5pinhibitor，进行CCK8细胞毒性实验和克隆形成实验，分析两种细胞对吉西他滨的IC50、耐药程度、细胞存活率和克隆形成度。
2.采用Trizol法提取miR-17-5pmimics组，NC组，17-5pinhibitor组，NC组的总RNA，对样本进行mRNA水平的qPCR实验。
3.在A549/G+细胞中转染miR-7-5pmimics和A549/G-细胞中转染miR-17-5pinhibitor，进行流式细胞周期实验；通过WesternBlotting实验测定RRM2、P21、PTEN、PI3K及CCNE1等相关蛋白的表达。
4.根据外泌体基因芯片结果和在线生物信息预测软件如TargetScan，miRDB等数据库，对miR-17-5p的靶基因进行预测，选择的原则是该基因具有物种保守性。
5.针对RRM2与miR-17-5p的结合位点设计基因片段，选取含有双萤光素酶的质粒pmirGLO，构建RRM2野生型WT和RRM2突变型MUT的载体，采用双萤光素酶实验进行靶基因的验证实验。
6.在A549/G+细胞中转染RRM2siRNA，干扰RRM2表达，通过CCK8细胞毒性实验来检测对细胞的IC50及细胞存活率的影响；采用克隆形成实验检测对细胞克隆斑形成能力的影响；进行流式细胞周期实验检测对细胞周期的影响；通过WesternBlotting实验检测对PTEN、P-AKT(Ser)、P21和CCNE1等蛋白的影响。
7.提取A549/G-细胞和A549/G+细胞的胞质与胞核蛋白，并在A549/G+细胞中转染P21siRNA，通过WesternBlotting实验检测胞质与胞核蛋白中P21的表达，及P21表达被抑制后，其对P21、PTEN、PI3K及CCNE1等相关蛋白的影响。
【结果】
1.在CCK8细胞毒性实验、克隆形成实验中，与对照组相比，实验组中miR-17-5p过表达使A549/G+细胞IC50值下降(P＜0.001)，细胞克隆斑形成数目降低(P＜0.05)，细胞增殖能力下降；抑制miR-17-5p表达使A549/G-细胞IC50值升高(P＜0.05)，细胞克隆斑形成数目增多(P＜0.05)，细胞增殖能力提高。这表明miR-17-5p过表达可降低A549/G+细胞对吉西他滨的耐药性，使细胞变敏感；抑制miR-17-5p表达可提高A549/G-细胞对吉西他滨的耐药性，使细胞变得更耐药。
2.在流式细胞周期实验中，与对照组比较，实验组miR-17-5p的过表达使A549/G+细胞周期的S期比例降低，G1期比例增高(P＜0.05)，同时WesternBlotting实验发现，细胞周期相关蛋白RRM2、P21、CCNE1及CCNA2表达均降低(P＜0.01)；抑制miR-17-5p的表达使A549/G-细胞周期的S期比例增高，G1期比例降低(P＜0.01)，同时WesternBlotting实验发现，细胞周期相关蛋白RRM2、P21、CCNE1及CCNA2均表达升高(P＜0.01)。
3.芯片及生物信息学预测RRM2是miR-17-5p的靶基因；双萤光素酶实验结果发现只有RRM2WT和miR-17-5pmimics组的萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶荧光强度比值较低(P＜0.01)，其他各组比值相差不多且均无统计学意义。
4.在CCK8细胞毒性实验、克隆形成实验中，与对照组比较，实验组A549/G+细胞IC50值下降(P＜0.001)，细胞克隆斑形成数目降低(P<0.05)，细胞增殖能力下降，同时WesternBlotting实验结果表明细胞周期相关蛋白P21、CCNE1、CCNA2表达均降低。
5.在流式细胞周期实验中，与对照组比较，RRM2siRNA可使实验组A549/G+细胞周期中S期比例降低，G1期比例增高(P＜0.05)。
6.在WesternBlotting实验中，A549/G+细胞与A549/G-细胞相比，PI3K和PTEN蛋白在A549/G+细胞中表达较高(P＜0.05)，而P-PTEN蛋白则表达较低(P＜0.01)；与对照组比较，miR-17-5p过表达使实验组P-PTEN蛋白表达升高(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白表达降低(P＜0.001)，PI3K和PTEN蛋白无差异；抑制miR-17-5p的表达，使P-PTEN蛋白表达降低(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白表达升高(P＜0.01)，PI3K和PTEN蛋白显差异。
7.WesternBlotting实验检测结果显示，与A549/G-胞质组比较，A549/G+胞质组P21蛋白表达增高(P<＜0.01)；对A549/G+细胞转染RRM2siRNA和P21siRNA后，实验组与对照组相比，RRM2siRNA组中P21、CCNE1、CCNA2蛋白表达水平均降低(P＜0.01)，P-PTEN蛋白表达升高(P＜0.001)，PI3K和P-AKT(Ser)蛋白表达无差异；P21siRNA组中CCNE1、CCNA2蛋白表达均降低(P＜0.01)，P-AKT(Ser)蛋白降低(P＜0.01)，RRM2蛋白表达升高(P＜0.01)，PI3K和PTEN蛋白无差异。
【结论】
1.在A549/G+细胞中，RRM2是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p过表达或抑制RRM2表达均可降低A549/G+细胞对吉西他滨的耐药性，这可能是通过使A549/G+细胞阻滞在G1期，无法顺利进入S期这一过程实现的；同理，在A549/G-细胞中，抑制miR-17-5p的表达水平，则可提高A549/G-细胞对吉西他滨的耐药性。
2.在A549/G+细胞中，P21可能是RRM2的下游基因，且与RRM2形成负反馈机制，CCNA2与CCNE1可能是P21的下游基因，这些基因共同构成了由miR-17-5p介导的A549/G+细胞的耐药机制的一部分。
3.在A549/G+细胞中，很有可能存在由P-PTEN缺失而激活的PI3K/AKT通路，且miR-17-5p上调或RRM2下调均可使P-PTEN蛋白增多，以此增强A549/G+细胞对吉西他滨的敏感性。。