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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国常用的药用植物，其干燥的根和根茎称为中药丹参，在临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗。丹酚酸类物质是它的药效成分之一，其合成、调控一直备受关注。丹酚酸的合成源于苯丙氨酸途径和酪氨酸途径，这两条途径上的关键酶基因大部分已经被克隆。目前对丹酚酸的调控研究也较为深入。多个参与调控丹酚酸类物质合成的转录因子被鉴定，然而从蛋白质翻译后修饰层面调控酚酸类物质合成的研究，鲜有报道。泛素化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，近年来发现其在次生代谢调控中起到重要作用。KFB(Kelchrepeat F-box)蛋白，作为SCF型泛素连接酶的一个重要亚基，能够识别并介导靶蛋白通过泛素-26S蛋白酶体系统降解。一些研究发现KFB蛋白能够调控次生代谢物质的合成，而丹参的KFB蛋白目前尚未被研究。因此，本研究以KFB蛋白为切入点，探究其在酚酸类物质代谢调控中的作用。
从丹参基因组中鉴定出31个SmKFB基因，经过系统发育树分析，发现5个SmKFB(SmKFB1、2、3、5和28)蛋白与已经报道参与其它植物次生代谢调控的KFB蛋白，具有较近的亲缘关系。用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)对丹参的毛状根进行处理，发现6个SmKFB(SmKFB1、2、5、6、11、15)表达量被MeJA强烈抑制，而另外两个SmKFB(SmKFB22、31)则在MeJA诱导下，表达量上调。组织特异性表达分析发现4个SmKFB(SmKFB4、11、16和17)主要在丹参的地上组织表达，而SmKFB5，25则主要在根中表达。结合系统发育树分析和基因表达分析，推测SmKFB1、2、5可能参与酚酸类物质的合成调控。
为验证SmKFB1、2和5在酚酸类物质合成中的作用，采用酵母双杂交实验，鉴定与SmKFB1、2和5互作的酚酸合成酶，发现SmKFB1与丹参迷迭香酸合酶(Rosmarinic acid synthase, RAS)之间存在微弱的互作关系；SmKFB2和丹参苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase,PAL)1、SmPAL3、SmRAS之间也存在微弱的互作关系；而SmKFB5则与SmPAL1、2、3之间存在强烈的互作关系。采用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)实验进一步验证它们之间的互作关系。当在烟草叶片中共表达YFPC-SmKFB5和YFPN-SmPAL融合蛋白时，在激光共聚焦显微镜下观察不到黄色荧光。将SmKFB5的F-box结构域去掉(即F^SmKFB5)再进行实验，发现共表达YFPC-F^SmKFB5和YFPN-SmPAL时，能够观察到明亮的黄色荧光，说明F^SmKFB5和SmPAL之间存在互作关系。而YFPN-SmPAL和YFPC-SmKFB5共表达，不发出黄色荧光，可能是YFPN-SmPAL蛋白被SmKFB5介导的泛素-26S酶体降解所致。
针对SmKFB5与SmPAL1、2、3之间互作的生物学意义，在烟草中分别使GFP-SmKFB5、GFP-F^SmKFB5与SmPAL-FLAG共表达，用Anti-FLAG抗体检测SmPAL-FLAG的蛋白表达量。研究发现当SmKFB5与SmPAL共表达时，基本上检测不到SmPAL的蛋白信号；而当F^SmKFB5与SmPAL共表达时，能够检测到SmPAL的蛋白信号，说明SmKFB5介导SmPAL蛋白通过泛素-26S蛋白酶体途径降解，同时也证明了YFPN-SmPAL和YFPC-SmKFB5共表达时，无荧光信号是由于SmKFB5介导SmPAL泛素化降解所致。
构建SmKFB5转基因毛状根。发现SmKFB5过表达株系中SmPAL的蛋白表达丰度低于对照株系，咖啡酸(Caffeic acid)积累量减少15%~40%，迷迭香酸(Rosmarinic acid)的积累量下降29~63%，丹酚酸B(Salvianolic acid B)的积累量下降50~60%。反之，在SmKFB5基因敲除株系中，SmPAL的蛋白表达丰度高于对照株系，咖啡酸积累量提高14%~22%，迷迭香酸的积累量提高28~46%，丹酚酸B的积累量提高17~38%。说明SmKFB5通过调控SmPAL的蛋白稳定性，负调控丹酚酸类物质的生物合成。
本研究首次从蛋白质泛素化调控层面揭示丹酚酸生物合成的调控机制，为进一步探索丹参药材品质形成规律，以及丹参种质资源改良提供理论依据。
从丹参基因组中鉴定出31个SmKFB基因，经过系统发育树分析，发现5个SmKFB(SmKFB1、2、3、5和28)蛋白与已经报道参与其它植物次生代谢调控的KFB蛋白，具有较近的亲缘关系。用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)对丹参的毛状根进行处理，发现6个SmKFB(SmKFB1、2、5、6、11、15)表达量被MeJA强烈抑制，而另外两个SmKFB(SmKFB22、31)则在MeJA诱导下，表达量上调。组织特异性表达分析发现4个SmKFB(SmKFB4、11、16和17)主要在丹参的地上组织表达，而SmKFB5，25则主要在根中表达。结合系统发育树分析和基因表达分析，推测SmKFB1、2、5可能参与酚酸类物质的合成调控。
为验证SmKFB1、2和5在酚酸类物质合成中的作用，采用酵母双杂交实验，鉴定与SmKFB1、2和5互作的酚酸合成酶，发现SmKFB1与丹参迷迭香酸合酶(Rosmarinic acid synthase, RAS)之间存在微弱的互作关系；SmKFB2和丹参苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase,PAL)1、SmPAL3、SmRAS之间也存在微弱的互作关系；而SmKFB5则与SmPAL1、2、3之间存在强烈的互作关系。采用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)实验进一步验证它们之间的互作关系。当在烟草叶片中共表达YFPC-SmKFB5和YFPN-SmPAL融合蛋白时，在激光共聚焦显微镜下观察不到黄色荧光。将SmKFB5的F-box结构域去掉(即F^SmKFB5)再进行实验，发现共表达YFPC-F^SmKFB5和YFPN-SmPAL时，能够观察到明亮的黄色荧光，说明F^SmKFB5和SmPAL之间存在互作关系。而YFPN-SmPAL和YFPC-SmKFB5共表达，不发出黄色荧光，可能是YFPN-SmPAL蛋白被SmKFB5介导的泛素-26S酶体降解所致。
针对SmKFB5与SmPAL1、2、3之间互作的生物学意义，在烟草中分别使GFP-SmKFB5、GFP-F^SmKFB5与SmPAL-FLAG共表达，用Anti-FLAG抗体检测SmPAL-FLAG的蛋白表达量。研究发现当SmKFB5与SmPAL共表达时，基本上检测不到SmPAL的蛋白信号；而当F^SmKFB5与SmPAL共表达时，能够检测到SmPAL的蛋白信号，说明SmKFB5介导SmPAL蛋白通过泛素-26S蛋白酶体途径降解，同时也证明了YFPN-SmPAL和YFPC-SmKFB5共表达时，无荧光信号是由于SmKFB5介导SmPAL泛素化降解所致。
构建SmKFB5转基因毛状根。发现SmKFB5过表达株系中SmPAL的蛋白表达丰度低于对照株系，咖啡酸(Caffeic acid)积累量减少15%~40%，迷迭香酸(Rosmarinic acid)的积累量下降29~63%，丹酚酸B(Salvianolic acid B)的积累量下降50~60%。反之，在SmKFB5基因敲除株系中，SmPAL的蛋白表达丰度高于对照株系，咖啡酸积累量提高14%~22%，迷迭香酸的积累量提高28~46%，丹酚酸B的积累量提高17~38%。说明SmKFB5通过调控SmPAL的蛋白稳定性，负调控丹酚酸类物质的生物合成。
本研究首次从蛋白质泛素化调控层面揭示丹酚酸生物合成的调控机制，为进一步探索丹参药材品质形成规律，以及丹参种质资源改良提供理论依据。