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目的:老年性白内障是全世界首位的可逆性致盲性眼病,其发病与晶状体上皮细胞(LECs)内活性氧簇(ROS)过量积聚及线粒体功能紊乱导致的细胞凋亡密切相关。目前认为过氧化氢(H2O2)是引起老年性白内障的最主要的氧化应激物质。近年的研究发现,一氧化碳(CO)分子作为体内血红素加氧酶(HO)的代谢产物之一,可以通过抗氧化、抗炎症、抗凋亡等分子机制对多种疾病起到治疗效果,具有潜在的临床应用价值。目前关于CO对晶状体上皮细胞是否具有保护作用未见报道。因此,为了进一步研究HO-1保护LECs的具体作用机制,初步探索CO预处理对LECs的保护效果,及CO与线粒体应激在H2O2诱导LECs损伤模型中相关性,本研究采用不同浓度的一氧化碳释放分子-3(CORM-3)作为CO释放的载体,并建立兔源性LECs的氧化应激损伤模型,同时优化H202及CORM-3的最佳浓度与作用时间,进一步探讨CORM-3预处理对于H2O2诱导的兔LECs损伤的保护效果及作用机制。方法:取新西兰兔前囊膜与赤道部囊膜,于体外分离、鉴定、培养原代LECs。CCK-8法确定H2O2、CORM-3及iCORM-3的最佳实验浓度及作用时间。氧合肌红蛋白(Mb02)检测CORM-3的CO释放。过氧化氫检测试剂盒检测H202浓度的时间变化曲线。免疫荧光染色与Western blot实验检测NF-κB p65细胞核转位及其在细胞质与细胞核中的表达量。ROS检测试剂盒、总谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒及超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒测定细胞内ROS、GSH及SOD含量变化。Western blot实验检测细胞凋亡分子表达量。AnnexinV-FITC/PI染色鉴定细胞凋亡。线粒体分离试剂盒分离完整的线粒体、细胞质蛋白及线粒体蛋白。Western blot实验检测线粒体再生转录相关分子的表达情况。三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒测定细胞内ATP含量,纯化细胞色素c氧化酶(COX)活性检测试剂盒检测线粒体COX活性,纯化线粒体膜通道孔(mPTP)荧光检测试剂盒检测活细胞mPTP开放程度,JC-1试剂检测线粒体膜电位(△ψm)水平,Western blot实验检测细胞质与线粒体内细胞色素c的表达量,免疫共沉淀(Co-IP)法检测COX与Bcl-2的结合情况。Bcl-2小干扰RNA(siRNA)瞬时转染LECs,测定其对线粒体代谢功能及线粒体凋亡通路的影响。所有实验均独立重复3次,所得到数据以SPSS22.0用以数据统计。组间差异性比较采用方差分析(ANOVA),Bonferroni检验用来比较各组间差异。当P<0.05认为差异有统计学意义。结果:实验条件下,CORM-3的CO释放速率为1mol/h,iCORM-3未检测到CO的释放。当CORM-3浓度>100μM,具有细胞致死性。H202与CORM-3之间不发生反应,CO的保护作用是特异性的。H202的最佳作用浓度为400μM,CORM-3的最佳作用浓度为50μM,;最佳作用时间是6h。CORM-3预处理可以抑制氧化应激诱导的NF-KBp65核转位,并恢复细胞质与细胞核中NF-KBp65的表达量,升高IKB的含量。CORM-3预处理可以降低细胞内ROS含量,上调GSH与SOD含量,并降低促凋亡分子Bax、caspase-3的表达,上调抗凋亡分子Bcl-2的含量,最终降低H202诱导的兔LECs凋亡。CORM-3预处理可以影响细胞线粒体再生、能量代谢及线粒体凋亡通路的活化。CORM-3预处理可以增加PGC-1a、NRF-1及mtTFA等线粒体再生转录相关分子的表达。CORM-3预处理可以增加细胞内ATP含量,恢复COX活性。此外,CORM-3预处理可以降低LECs的mPTP开放程度,增加线粒体膜通透性,抑制细胞色素c线粒体转位,最终抑制线粒体凋亡通路的激活。CORM-3预处理可以增加COX与Bcl-2的结合,Bcl-2siRNA瞬时转染结果提示,沉默bcl-2会抵消CORM-3对线粒体再生、线粒体能量代谢及线粒体凋亡通路的调控作用。结论:低浓度CO预处理兔LECs可以通过抑制NF-κB p65核转位、减少细胞内ROS生成及恢复细胞内抗氧化酶含量,减轻H202氧化损伤诱导的细胞凋亡。同时,低浓度CO预处理兔LECs可以通过增强线粒体再生与细胞能量代谢,抑制线粒体凋亡通路的激活,减轻H202氧化损伤诱导的细胞功能失代偿。此外,Bcl-2的表达对于CO介导的线粒体功能调控作用是必须的。