论文部分内容阅读
目的：检测斑马鱼不同组织、不同时相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）酶活性。构建g6pd-pCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒。观察斑马鱼中g6pd的表达情况，为构建G6PD缺乏症的斑马鱼疾病模型奠定基础。 方法1．运用改良的G6PD定量比值法检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎中G6PD酶活性；2．重组质粒的构建：（1）提取野生型斑马鱼Total RNA，将RNA逆转录为斑马鱼cDNA，通过RT-PCR法克隆得到斑马鱼g6pd基因全长，将g6pd基因与pCS2+空载体连接获得g6pd-pCS2+重组质粒；（2）利用g6pd-pCS2+重组质粒制备地高辛标记的反义mRNA探针，在野生型斑马鱼Tuebingen进行原位杂交，观察g6pd基因的表达情况；（3）g6pd-pCS2+重组质粒鉴定正确后，运用重叠延伸定点诱变原理设计出突变型mutant g6pd基因，将mutant g6pd基因与EGFP-pCS2+质粒重组构建突变型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒。3．利用RT-PCR检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎g6pd基因mRNA水平表达情况；4．利用显微注射技术将mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒注入斑马鱼胚胎中，观察绿色荧光蛋白的表达。结果1．用改良的G6PD定量比值法检测野生型成年斑马鱼脑、眼睛、鱼鳃、肠、肌肉、皮肤以及血等各组织G6PD酶活性，结果为：脑1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、鱼鳃1.7347±0.1901、肠1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮肤1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑马鱼体积较小，血量较少，但本研究发现在斑马鱼的各个组织当中同样能够检测斑马鱼的酶活性。同时利用相同的方法检测斑马鱼胚胎各时相的酶活性，包括24小时、48小时、5天、15天，检测结果如下：24小时1.7429±0.1701、48小时1.7495±0.1296、5天1.7118±0.2236、15天1.7621±0.1690。2．成功设计突变体mutant g6pd基因；3．构建g6pd-EGFP-pCS2+、突变型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒；4．制备出斑马鱼g6pd基因反义mRNA探针；5．将mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒显微注射入斑马鱼胚胎内，在荧光显微镜下观察到荧光表达情况。结论1．本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑马鱼中检测各个组织及各个时相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了检测斑马鱼G6PD酶活性的技术。2．本研究所得的结果提示斑马鱼中不同组织以及不同的胚胎酶活性检测结果无显著差异，通过在斑马鱼中检测不同组织及不同时相胚胎的G6PD酶活性，在斑马鱼中建立了G6PD酶活性的标准值。3．本研究采用新型模式生物斑马鱼，首次通过原位杂交观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎不同发育时相中的表达情况。4．人工设计mutant g6pd基因，运用基因重组原理成功构建mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒，并且通过显微注射入斑马鱼体内，可以追踪绿色荧光蛋白的表达情况，证实构建的重组质粒，并且已经成功的构建了GATA-1 promoter-mutant g6pd-EGFP-PBSK IsceI重组质粒，为下一步建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。