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目的运用代谢组学方法研究刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysacharides,ASPS)对免疫性肝损伤小鼠的保护作用,寻找潜在的生物标志物分析其代谢途径,并探讨ASPS中发挥作用的主要组分及作用机制。方法1.将40只BALB/c小鼠随机分为四组,即空白组、刺五加多糖给药组(生理给药组)、刀豆蛋白A(ConA)模型组及ConA模型给药组(病理给药组),空白组和模型组给予0.9%生理盐水(10mg/mL),生理给药组和病理给药组给予刺五加多糖水溶液(14.5mg/mL),连续灌胃7天。除空白组和生理给药组外,其余两组于第7天末次给药0.5h后尾静脉注射ConA水溶液(2.0mg/mL),禁食不禁水8h后取肝脏及脾脏。制备10%肝组织及脾组织匀浆液,采用代谢组学方法对生理和病理状态下小鼠肝、脾组织匀浆液进行分析,查找潜在生物标志物及代谢通路。2.利用D941树脂对浓度为10mg/mL的刺五加多糖溶液进行脱蛋白质和脱色素。将所得刺五加多糖溶液经DEAE-Sepherose F.F阴离子交换树脂柱及Sephadex-G200分子筛柱进一步分离纯化。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质脱除率,采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,并于波长420nm处检测OD值,计算色素脱除率。3.将60只BALB/c小鼠随机分为六组,即空白组、刀豆蛋白A(ConA)模型组、阳性药(联苯双酯)组及ASPS-1-1、ASPS-2-1、ASPS-3-1组,空白组和模型组给予0.9%生理盐水(10mg/mL),阳性药组(20mg/mL)、ASPS-1-1 组(6.9mg/mL)、ASPS-2-1组(4.6mg/mL)、ASPS-3-1组(2.0mg/mL)灌胃给药,连续7天,利用ConA建立免疫性肝损伤模型后,取小鼠血清、肝脏及脾脏备用。肝组织匀浆液用于GSH、SOD、MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平检测,血清和脾组织匀浆液用于IL-2、IL-4、IL-6、IFN--γ水平检测。结果1.在生理状态下小鼠肝脏中筛选出27个生物标志物,其中正离子模式下19个,负离子模式下8个,脾脏中筛选出53个生物标志物,正离子模式下21个,负离子模式下32个,相关的代谢通路有鞘脂类代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、胆汁的分泌等。在病理状态下小鼠肝脏中筛选出36个生物标志物,其中正离子模式下17个,负离子模式下19个,脾脏中筛选出41个生物标志物,正离子模式下24个,负离子模式下17个,相关的代谢通路有半胱氨酸和蛋氨酸代谢、柠檬酸循环、嘌呤代谢等。2.经D941树脂柱初步去杂质后的刺五加多糖溶液,其脱蛋白率为88.26%,脱色率为88.66%,多糖保留率达82.81%。将所得溶液过DEAE-Sepherose F.F柱,得到3个单一对称峰,表明刺五加多糖被分成3个较纯的组分,被命名为ASPS-1、ASPS-2和ASPS-3。采用Sephadex-G200凝胶过滤柱对这3个组分进一步纯化后均得到1个单一对称峰,表明洗脱出来的多糖组分均一纯化,进一步纯化后所得的3个组分分别被命名为 ASPS-1-1、ASPS-2-1 和 ASPS-3-1。ASPS-1、ASPS-2 和 ASPS-3 组分占刺五加多糖的百分比分别为47%、32%、13%,并初步判断ASPS-1为中性多糖,ASPS-2和ASPS-3组分为酸性多糖。3.与模型组相比,ASPS-1-1能够降低小鼠肝脏指数及脾脏指数;增加肝组织中GSH、SOD水平,降低MDA、IL-1β、NO、TNF-α水平;降低血清和脾组织中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r水平。ASPS-2-1能够降低肝脏指数;增加肝组织中GSH水平,降低肝组织中MDA、TNF-α水平及血清中IL-2水平。结论1.生理状态与病理状态下小鼠肝脾组织中共有23个共同的生物标志物,刺五加多糖主要通过干预生理状态与病理状态共有的谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路发挥作用。此外,还有非共有的病理状态下相关的柠檬酸循环、胆汁分泌、牛磺酸代谢等通路在肝损伤中也发挥一定的作用。刺五加多糖可能通过提高机体免疫能力、抗炎、抗氧化、供应机体所需能量等机制实现其对免疫性肝损伤小鼠的保护作用。2.刺五加多糖通过D941树脂柱初步除杂,再经DEAE-Sepherose F.F柱分离纯化得到中性多糖ASPS-1、酸性多糖ASPS-2和ASPS-3三个组分,其中ASPS-1在刺五加多糖中所占比例最多。将ASPS-1、ASPS-2和ASPS-3经Sephadex-G200凝胶过滤柱进一步分离纯化得到ASPS-1-1、ASPS-2-1和ASPS-3-1三个均一组分。3.ASPS-1-1组分在免疫性肝损伤的保护与修复中发挥主要作用,主要通过调节炎性细胞因子水平及氧化应激相关酶的活性来实现其对免疫性肝损伤的保护作用,此外,ASPS-2-1组分对肝脏损伤也有一定的保护作用。