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基于生物材料支架的骨组织工程技术在治疗严重骨缺损中有着较高的应用潜力。源于骨组织的骨脱细胞基质（DBM）因保留了骨组织中的部分生物活性成分，能够特异性诱导骨的再生和修复。近年来，已有多种形式的DBM被应用于骨组织再生。然而，现有的基于DBM生物材料面临着批次间差异、理化性质难以调控等问题。基于电纺丝技术制备的超细纤维能够仿生天然骨组织细胞外基质（ECM），是一种极具潜力的制备骨组织工程支架的方法。若将DBM通过电纺方式制备成纳米纤维支架，能够为这类材料的应用提供更为灵活的平台。另外，骨组织工程支架的血管化对于骨再生有重要影响。源于脂肪组织的脂肪提取液（FE）含有多种与血管新生相关的生长因子和细胞因子，在局部缺血治疗以及脂肪移植、皮瓣移植等手术中具有促血管新生的功能。基于FE的促血管新生能力，若将FE结合到骨组织工程支架中，能够为解决骨再生中血管化的问题提供新的思路，但目前FE在骨组织工程中的应用还未见报道。
基于以上研究背景，本论文的主要研究目的是：1）制备含DBM的左旋聚乳酸（PLLA）基电纺纳米纤维（PLLA/DBM）支架，并研究其对于干细胞的成骨诱导功效；2）在PLLA/DBM纳米纤维支架表面吸附具有促血管化潜能的FE，增强该纤维的促血管化能力。
为此，本课题首先利用脱细胞技术制备源于猪股骨的DBM，并通过酶消化法将其变为可溶形式，利用电纺丝技术将DBM与合成材料PLLA共混制备PLLA/DBM纳米纤维。然后，对该纤维的形貌、化学组成、水浸润性、力学性能等进行表征。随后，在PLLA/DBM纤维上培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），探究含有DBM的纳米纤维对BMSCs增殖、形貌、成骨分化等行为的影响，并将材料浸泡于模拟体液（SBF）中，评估材料的矿化能力。结果表明：1）利用脱细胞技术可成功制备DBM，组织学染色和DNA定量结果表明DBM完全去除了细胞核成分，并且对骨基质中的胶原成分有较好的保留。2）经过酶消化处理的DBM能够溶于六氟异丙醇（HFIP），DBM与PLLA共混电纺制备了4种比例的PLLA/DBM纳米纤维（10∶0，9∶1，7∶3，5∶5），各比例纤维均形貌均匀，直径分布于100-400nm。傅里叶红外光谱（FTIR）结果表明PLLA与DBM成功复合。随着DBM含量升高，纤维的亲水性增强，但拉伸力学性能有所下降。3）PLLA/DBM纤维能够支持BMSCs的增殖和黏附，7∶3比例纤维对于细胞增殖的促进作用最为明显，结合材料表征结果，选择这一比例进行后续实验。细胞在7∶3比例PLLA/DBM纤维上有更好的细胞铺展行为，碱性磷酸酶（ALP）检测、茜素红S（ARS）染色、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR结果表明7∶3比例纤维有利于BMSCs向成骨分化。体外矿化实验结果证明DBM的引入有利于纳米纤维在模拟体液（SBF）中的矿化，可以预测这种纤维支架在体内有良好的骨结合性。
在上述工作基础上，为进一步增强PLLA/DBM纳米纤维的生物功能化，本课题选择一种具有促血管新生的新型无细胞生物材料脂肪提取物（FE），通过物理吸附和聚多巴胺（PDA）涂层介导的吸附两种方式在PLLA/DBM纳米纤维表面固定FE，对两种方法的固定效果进行检测，并探究以不同吸附方式负载FE的PLLA/DBM纳米纤维对BMSCs及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞行为的影响。结果表明：1）PDA涂层能够提高FE在PLLA/DBM纳米纤维上的固定效率，将PLLA/DBM纳米纤维置于5%FE溶液中孵育4h后，FE固定率即可达70%以上，而物理吸附方式对FE的固定效率相对较低。2）PDA涂层能够促进BMSCs的ALP表达，但抑制了细胞增殖，FE的存在对于BMSCs的增殖、形貌、分化没有表现出明显的影响。3）PDA涂层使HUVECs在PLLA/DBM纳米纤维上的增殖变弱，在纤维上物理吸附FE能够促进内皮细胞的增殖和迁移。
总之，本研究首次通过电纺构建了PLLA/DBM纳米纤维支架并评价其成骨性能，并且初步探究了该支架上负载FE的方式及其对于BMSCs和HUVECs细胞行为的影响。实验结果表明，PLLA/DBM纳米纤维具有良好的体外骨诱导性，在骨组织工程中有较好的应用前景；物理吸附FE对于支架的促血管化潜能有促进作用，而FE的存在是否有利于骨再生，需要深入的研究加以证实。
基于以上研究背景，本论文的主要研究目的是：1）制备含DBM的左旋聚乳酸（PLLA）基电纺纳米纤维（PLLA/DBM）支架，并研究其对于干细胞的成骨诱导功效；2）在PLLA/DBM纳米纤维支架表面吸附具有促血管化潜能的FE，增强该纤维的促血管化能力。
为此，本课题首先利用脱细胞技术制备源于猪股骨的DBM，并通过酶消化法将其变为可溶形式，利用电纺丝技术将DBM与合成材料PLLA共混制备PLLA/DBM纳米纤维。然后，对该纤维的形貌、化学组成、水浸润性、力学性能等进行表征。随后，在PLLA/DBM纤维上培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），探究含有DBM的纳米纤维对BMSCs增殖、形貌、成骨分化等行为的影响，并将材料浸泡于模拟体液（SBF）中，评估材料的矿化能力。结果表明：1）利用脱细胞技术可成功制备DBM，组织学染色和DNA定量结果表明DBM完全去除了细胞核成分，并且对骨基质中的胶原成分有较好的保留。2）经过酶消化处理的DBM能够溶于六氟异丙醇（HFIP），DBM与PLLA共混电纺制备了4种比例的PLLA/DBM纳米纤维（10∶0，9∶1，7∶3，5∶5），各比例纤维均形貌均匀，直径分布于100-400nm。傅里叶红外光谱（FTIR）结果表明PLLA与DBM成功复合。随着DBM含量升高，纤维的亲水性增强，但拉伸力学性能有所下降。3）PLLA/DBM纤维能够支持BMSCs的增殖和黏附，7∶3比例纤维对于细胞增殖的促进作用最为明显，结合材料表征结果，选择这一比例进行后续实验。细胞在7∶3比例PLLA/DBM纤维上有更好的细胞铺展行为，碱性磷酸酶（ALP）检测、茜素红S（ARS）染色、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR结果表明7∶3比例纤维有利于BMSCs向成骨分化。体外矿化实验结果证明DBM的引入有利于纳米纤维在模拟体液（SBF）中的矿化，可以预测这种纤维支架在体内有良好的骨结合性。
在上述工作基础上，为进一步增强PLLA/DBM纳米纤维的生物功能化，本课题选择一种具有促血管新生的新型无细胞生物材料脂肪提取物（FE），通过物理吸附和聚多巴胺（PDA）涂层介导的吸附两种方式在PLLA/DBM纳米纤维表面固定FE，对两种方法的固定效果进行检测，并探究以不同吸附方式负载FE的PLLA/DBM纳米纤维对BMSCs及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞行为的影响。结果表明：1）PDA涂层能够提高FE在PLLA/DBM纳米纤维上的固定效率，将PLLA/DBM纳米纤维置于5%FE溶液中孵育4h后，FE固定率即可达70%以上，而物理吸附方式对FE的固定效率相对较低。2）PDA涂层能够促进BMSCs的ALP表达，但抑制了细胞增殖，FE的存在对于BMSCs的增殖、形貌、分化没有表现出明显的影响。3）PDA涂层使HUVECs在PLLA/DBM纳米纤维上的增殖变弱，在纤维上物理吸附FE能够促进内皮细胞的增殖和迁移。
总之，本研究首次通过电纺构建了PLLA/DBM纳米纤维支架并评价其成骨性能，并且初步探究了该支架上负载FE的方式及其对于BMSCs和HUVECs细胞行为的影响。实验结果表明，PLLA/DBM纳米纤维具有良好的体外骨诱导性，在骨组织工程中有较好的应用前景；物理吸附FE对于支架的促血管化潜能有促进作用，而FE的存在是否有利于骨再生，需要深入的研究加以证实。