论文部分内容阅读
【目的】纳米颗粒具有独特的物理、化学和生物特性,越来越广泛地被应用于生产生活的各个领域中。它们在这些领域的应用带来了巨大的经济效益,但同时也产生潜在的生物安全性与环境安全性等问题而引起世界范围的广泛关注。心血管疾病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病,而空气细微颗粒物与心血管疾病之间的密切关系已得到证实,有研究表明碳纳米颗粒进入肺部后能转移到心血管系统,因此纳米颗粒的心血管毒性格外引人注目。一些研究结果显示纳米颗粒可引起一系列与细胞代谢、凋亡、细胞周期、应激反应、细胞信号转导和炎症反应相关基因的mRNA水平的改变。其损伤机制尚无定论,目前研究较多的是氧化应激机制。血管内皮细胞为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞,它的损伤与功能紊乱和多种心血管系统疾病的发生有密切的关系。因此,研究目前应用最多的纳米材料之一,多壁碳纳米管(MWCNTs)对血管内皮细胞的损伤及其机制,对了解纳米材料在心血管疾病方面的潜在危害有着积极的意义。本实验采用体外实验探索MWCNTs引起血管细胞的损伤作用及其机制。观察MWCNTs对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞活力、DNA损伤作用、ROS水平、过氧化反应和炎症因子分泌的影响。为了模拟体内的复杂环境,将HUVECs和人单核细胞THP-1细胞共培养后,观察MWCNTs对HUVECs的毒性作用,为评价MWCNTs的潜在心血管毒性及其作用机制提供实验依据。【方法】1.细胞毒性、凋亡、DNA损伤检测用台盼蓝染色法观察不同浓度(0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/ml)的MWCNTs对HUVECs的存活率的影响,设定本实验的剂量范围。用倒置显微镜观察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞形态变化;用透射电镜观察MWCNYs(20μg/ml)处理后HUVECs24h细胞吞噬MWCNTs的情况及细胞形态学改变。用检测细胞凋亡的试剂盒检测MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞凋亡的情况。用免疫荧光法观察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)焦点形成情况,比较细胞核内焦点形成的数量及荧光强度。免疫荧光显微镜图片用Image Pro Plus软件进行γH2AX焦点定量计数。2.氧化还原状态检测用DCFH-DA法检测MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞内ROS水平的变化情况。用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定细胞内MDA的含量、黄嘌呤氧化酶法测SOD活力,通过还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量来测定GSH-Px活力。3.炎症因子检测用酶联免疫试剂盒(ELISA)检测MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞培养液中炎症因子TNF-α的变化。4.NAC预处理后的变化NAC(6mM)预处理后,1)用试剂盒检测MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞凋亡的情况。2)用DCFH-DA法检测MWCNYs(0.5、5、20μg/ml)处理后HUVECs细胞内的ROS水平变化。3)用免疫荧光技术检测MWCNTs(5μg/ml)处理后HUVECs细胞γH2AX焦点形成情况,与NAC预处理前进行比较。5.HUVECs与THP-1细胞共培养后细胞内ROS的变化将HUVECs与THP-1细胞共培养后,用DCFH-DA法检测MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)处理共培养细胞系后HUVECs内的ROS水平变化。与未共培养时的结果比较。6.所有结果采用SPSS统计软件分析。【结果】1.细胞毒性、凋亡、DNA损伤检测结果0、0.5、2、5、10、20μg/ml MWCNTs作用下,HUVECs细胞的存活率均在70%以上,随着染毒浓度的增高,细胞存活率下降,并存在剂量和时间依赖关系。正常HUVECs细胞生长状态良好,呈连续分布,互不重叠,细胞形状规则,呈典型铺路石状排列。随着MWCNTs浓度增加,死亡悬浮细胞增多,且细胞形态改变明显。透射电镜显示20μg/ml染毒组细胞胞浆中空泡状结构增多,并吞噬有MWCNTs,细胞核不规则,出现核皱缩。MWCNTs作用24h后,各浓度的MWCNTs都促进了HUVECs细胞的凋亡,与对照组比较有显著性差异。免疫荧光实验发现,空白对照组中大部分(＞80%)细胞核内无γH2AX的存在,只有少数细胞核内可发现少许γH2AX。各剂量MWCNTs处理细胞后,均可引起细胞核内γH2AX焦点形成,并有剂量依赖性。与空白对照组相比有显著性差异。2.氧化还原状态检测结果细胞内的ROS水平随着MWCNTs浓度升高而升高。20μg/ml MWCNTs能引起细胞ROS水平的显著增高,且有时间依赖关系。随着MWCNTs浓度的增高,HUVECs细胞内MDA含量显著增加,其中5、20μg/ml组与对照组比较有显著性差异。当MWCNTs浓度较低时(0.5、5μg/ml),细胞内GSH-Px增加,与对照组比较有显著性差异,而当MWCNTs浓度升高到20μg/ml时GSH-Px又降低。SOD的变化与GSH-Px的变化相似。3.炎症因子检测结果MWCNTs对HUVECs细胞炎症因子TNF-α的产生没有明显的影响。4.NAC预处理后的变化结果经6mM NAC预处理后,1)细胞凋亡率与未处理的染毒组相比均有降低,其中0.5μg/ml剂量组与同剂量单纯MWCNTs处理组相比具有显著性差异。2)与单纯MWCNTs处理组相比,形成γH2AX焦点的阳性细胞明显减少,具有显著性差异(p＜0.01)。3)细胞内ROS水平明显降低,其中5、20μg/ml剂量组与同剂量单纯MWCNTs处理组相比具有显著性差异。5.HUVECs与THP-1细胞共培养后的变化结果HUVECs与THP-1细胞共培养后,HUVECs中的ROS含量均比未共培养时的ROS含量增加,20μg/ml组有显著差异。【结论】MWCNTs能进入HUVECs细胞,降低细胞的存活力,诱导细胞凋亡和DNA损伤,并伴有ROS水平升高和细胞氧化还原失衡。提示MWCNTs诱导HUVECs损伤的机制可能与ROS增加,引起氧化损伤有关。粒细胞的存在可能促进MWCNTs引起的内皮细胞氧化损伤。