粉尘螨主要过敏原Derf 2基因的克隆表达及分子改造的初步研究

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背景:过敏原浸提液定量及标准化困难,给临床应用造成了障碍;同时,由于生活环境的不同,蛋白水平的研究显示,国外螨过敏原蛋白与本地螨过敏原蛋白存在差异,直接应用外国螨过敏原进行脱敏治疗产生的副作用较大。目的:克隆本地粉尘螨(Dermtophagoides farinae,Der f)中的主要过敏原基因并进行抗原性分析改造,以减小其过敏原性,提高临床应用安全性。方法:采用RT-PCR的方法进行基因克隆;运用在线生物信息学软件SYFPEITHI对各区段的抗原性进行分析;确定关键肽段后理论上进行氨基酸置换,通过重叠PCR和桥式PCR进行改造;利用软件对置换前后的过敏原蛋白的空间结构进行了比较。结果:对克隆得到的产物的测序结果显示,成功克隆得到螨虫中的过敏原基因Der f2。对Derf 2与前期克隆得到的Derf 1进行抗原性分析后,确定了对抗原性贡献较大的区段,并在计算机水平对相应的区段进行了置换突变;空间结构分析发现,改变前后的过敏原蛋白三级结构存在一定的差异。同时,采用重叠引物与桥式PCR相结合的方法对这些区段进行了突变,目前已经获得部分区段业经改造的基因片段。同时,对原始克隆的Der f 2进行了表达载体构建。意义:本研究建立了从基因克隆到抗原性评价的方法体系,并对Der f1和Der f 2过敏原蛋白进行了改造尝试,为后续工作奠定了基础。同时发现本地粉尘螨过敏原基因与国外发表的过敏原基因序列存在少数碱基差异,推测所检测的功能差异可能来自蛋白表达后的修饰所造成。
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