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帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病,选择性的中脑黑质多巴胺能神经元丧失、纹状体多巴胺含量显著性减少为其特征性的生化和病理特征。临床上主要表现为肌强直、震颤、运动迟缓及姿势步态障碍。目前PD的治疗仍是以左旋多巴等药物治疗为主,然而长期用药会出现疗效减退、异动症甚至左旋多巴衰竭综合征等棘手的临床问题,至今还无法得到满意的解决。目前的研究认为PD患者长期服用半衰期较短的外源性多巴药物,可造成对基底节纹状体棘状神经元上多巴胺受体异常的波动性刺激,从而引发了皮质纹状体通路及纹状体内部,包括非多巴胺受体的表达及功能、信号转导、基因表达等一系列的可塑性改变,使本已失衡的多巴胺能环路更加异常,这可能是异动症产生的主要病理机制。近年来有学者开始关注棘状神经元上非多巴胺受体异常改变对异动症发病的影响,并试图寻找一种新的非多巴胺能的药物来替代或与他药合用以减轻不良反应,延缓病情进展。腺苷是内源性的嘌呤核苷,是中枢神经系统一种十分重要的神经调质；腺苷可通过腺苷受体调节神经递质释放和突触后神经元反应。腺苷A2A受体选择性分布于基底节,与D2受体共同表达于间接通路的GABA能神经元,有调节基底节功能的作用。动物实验发现腺苷A2A受体基因敲除的PD模型鼠在接受左旋多巴治疗后不会产生疗效减退现象,说明腺苷A2A受体可能参与了PD运动并发症的发病,对腺苷A2A受体功能的调控可能有益于缓解PD运动并发症。
因此,本课题首先研究了腺苷A2A受体拮抗剂CSC用药对PD运动并发症的影响及腺苷A2A受体表达的改变,并进一步研究了CSC用药对信号转导蛋白磷酸化的DARPP-32和ERK表达数量及位点的影响,以探讨腺苷A2A受体对运动并发症的调节机制。本研究拟采用左旋多巴诱导的运动并发症大鼠模型探讨腺苷A2A受体在运动并发症发病机制中的作用。
本课题共分为四个部分:
第一部分:左旋多巴用量对帕金森病运动并发症大鼠模型行为学的影响
通过6-羟基多巴立体定向注射至SD大鼠前脑内侧束建立PD大鼠模型。成功的PD大鼠随机分入小剂量组和大剂量组,分别予10 mg/kg和50mg/kg左旋多巴甲酯腹腔注射,每天两次,持续21天,比较两组大鼠模型AIM各组分的评分和旋转反应的差异。两种左旋多巴用药剂量可诱发PD大鼠出现相似程度的口面、上肢、轴向AIM和旋转反应时间的缩短；但大剂量组大鼠旋转AIM的评分高于小剂量组,且旋转反应时间缩短幅度大于小剂量组。上述研究表明,观察AIM行为可选用20 mg/kg/day的小剂量用药,以诱发PD大鼠出现非常明显的AIM,又可避免过于剧烈的旋转运动对AIM评分的干扰；但观察旋转反应时间的缩短,需要选用高剂量的左旋多巴用药以诱导出现稳定下降的旋转反应时间。
第二部分:腺苷A2A受体拮抗剂CSC改善PD运动并发症的实验研究
通过6-羟基多巴立体定向注射至大鼠前脑内侧束建立PD动物模型。PD模型成功大鼠接受每日2次左旋多巴甲酯(50 mg/kg加12.5 mg/kg苄丝肼)腹腔注射,持续22天。在第23天,运动并发症模型组大鼠继续接受如上用药,用药组在左旋多巴注射前加用腺苷A2A受体拮抗剂CSC,两组大鼠均用药至第29天。评估旋转时间,并采用免疫组化和蛋白印迹法观察和检测纹状体区腺苷A2A受体的表达情况。结果显示CSC用药逆转了左旋多巴诱导的PD大鼠旋转时间的缩短,同时使损伤侧纹状体区腺苷A2A受体的表达也下调至对照组和PD组水平。上述结果表明,波动性多巴胺刺激引起的纹状体腺苷A2A受体的表达上调可能是一种失代偿现象。抑制腺苷A2A受体,从而协调直接通路和间接通路的功能以控制左旋多巴诱发的运动并发症是有前景的治疗思路。
第三部分:腺苷A2A受体拮抗剂CSC对运动并发症大鼠纹状体DARPP-32和ERK磷酸化表达数量的调节
采用免疫印迹法检测纹状体区DARPP-32(Thr75)和ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化表达的改变。结果显示,假手术组、PD组、模型组和用药组纹状体DARPP-32和ERK的总蛋白表达量无明显改变。但PD组损伤侧DARPP-32(Thr75)的表达增加,而ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化表达降低；左旋多巴长期用药后,使DARPP-32(Thr75)在损伤侧纹状体的表达量降低,而ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化表达升高；CSC用药可逆转波动性左旋多巴用药引起的DARPP-32(Thr75)表达的降低和ERK(Thr202/Tyr204)表达的增高。研究结果说明DARPP-32和ERK的异常磷酸化参与了运动并发症的发生,CSC用药可逆转这两种信号转导蛋白的异常改变,提示表达增多的腺苷A2A受体可能通过激活下游信号转导通路参与了PD运动并发症的发生。
第四部分腺苷A2A受体拮抗剂CSC对帕金森病运动并发症大鼠纹状体磷酸化DARPP-32和ERK表达位点的调节
采用免疫荧光染色检测磷酸化DARPP-32(Thr75)和ERK(Thr202/Tyr204)与强啡肽的共表达情况。结果显示,PD大鼠损伤侧纹状体磷酸化DARPP-32(Thr75)大部分位于表达强啡肽的直接通路投射神经元；长期左旋多巴用药明显降低了模型组大鼠损伤侧强啡肽阳性神经元内DARPP-32Thr75位点的磷酸化表达；CSC用药后损伤侧纹状体区DARPP-32Thr75位点磷酸化的阳性细胞数较模型组明显升高,但CSC的调节作用主要发生在间接通路投射神经元。PD组纹状体区仅检测到少量磷酸化ERK(Thr202/Tyr204)分布,多在强啡肽阴性神经元表达；长期左旋多巴用药明显升高了强啡肽阳性神经元内磷酸化ERK(Thr202/Tyr204)的表达；CSC用药显著下调了直接通路投射神经元的磷酸化ERK(Thr202/Tyr204)表达。研究结果说明CSC可下调强啡肽阳性神经元的ERK磷酸化,上调强啡肽阴性神经元的DARPP-32Thr75位点的磷酸化,提示CSC通过协调直接通路和间接通路的功能发挥改善PD运动并发症的作用。