论文部分内容阅读
目的构建瑞替普酶r-PA融合蛋白的原核表达体系，并研究DsbA、DsbC、pKJE7、pGro7、pTf16等分子伴侣对其复性的影响。方法：将r-PA基因克隆到表达载体质粒PET-32a中，经PCR及EcoR I、BamH I双酶切鉴定后将重组表达载体PET-32a-r-PA转化至感受态大肠杆菌BL21，通过筛选得到阳性克隆后经IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE和Western blot鉴定。目的蛋白包涵体变性后经镍离子金属螯合层析纯化。37℃培养含有表达分子伴侣蛋白基因重组质粒的工程菌，IPTG诱导表达。在r-PA融合蛋白复性时分别添加不同分子伴侣，研究不同分子伴侣对融合蛋白体外复性的影响。最后采用纤维蛋白-琼脂糖平板测定法测算纯化、复性后样品的单位活性。结果：经PCR及EcoR I、BamH I双酶切鉴定结果表明重组表达载体PET-32a-r-PA构建成功；SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明r-PA融合蛋白得到正确表达；添加分子伴侣参与复性后结果显示添加DsbA、pKJE7、pTf16蛋白组的辅助复性效果明显，复性率达20%左右；纤溶活性检测表明纯化、复性后样品具有纤溶活性，通过计算得到样品的比活为4.8x10~5IU/mg。结论：分子伴侣能有效帮助r-PA融合蛋白的复性。