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背景：肿瘤转移的发生受到多种因素的调控，是多种生物分子和信号通路在时间和空间上复杂作用的结果，因此，研究探索淋巴道转移的关键分子机制和通路，并在此基础上发展出有效的干预手段，对于临床肿瘤患者的诊断与治疗具有重要的现实意义。磷脂是组成膜脂质双层的主要成分，膜磷脂在保持和调节细胞功能以及在细胞信号传导和细胞周期的调节中都发挥着重要作用。磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）是组成生物膜的主要成分，生物膜两侧磷脂分布不对称，膜内外两侧磷脂的脂肪酸也不完全相同，极大地影响着细胞功能。近年研究发现磷脂及其代谢产物的变化与肿瘤的转移存在密切关系，黑色素瘤的血行肺转移灶PS含量和不同进展阶段肿瘤细胞系的恶性程度相关。磷脂的各种组分在肿瘤转移过程中发挥着多种多样的作用，因此通过抑制细胞增殖、运动、粘附、信号转导、免疫等环节来开发新型抗癌药物，基于磷脂分子的肿瘤靶向治疗研究受到广泛的关注。但膜磷脂成分变化与癌淋巴道转移力相关性的研究还未被涉及。榄香烯是我国自行研制开发的国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物，它以β-榄香烯（β-elememe）为主要成分，实验药理学研究证实榄香烯对体内多种肿瘤细胞具有较强的抑制和杀伤效应，可抑制多种肿瘤细胞的生长，具有广谱的抗肿瘤作用。姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的，是一种植物多酚，具有多种药理活性，在抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等方面均有重要作用。所以，深入研究榄香烯和姜黄素抗肿瘤作用机制具有重要的现实意义。本课题组从小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移株HCa-P（淋巴结转移率﹤20%）中筛选出具有多部位转移特性的淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6（淋巴结转移率为100%），此细胞系对药物敏感型增高。HCa-P/L6与HCa-P具有基本相同的遗传背景，是研究肿瘤转移机制及筛选抗肿瘤药物的一对可互为参照的肿瘤淋巴道转移细胞模型。目前，本课题组采用有限稀释法对HCa-P进行再克隆，得到4株单克隆细胞：一个无转移株H5和三个低转移株G2、B8、E10，作为研究肝癌淋巴道转移的对象，是更为理想的研究肿瘤淋巴道转移的细胞株模型。目的：1.以小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移系（HCa-P/L6和HCa-P）为研究对象，通过高转移系HCa-P/L6和低转移系HCa-P的膜磷脂变化的比较，探索膜磷脂变化规律与肿瘤发生发展的关系，为阐明肿瘤转移机制奠定基础。2.以HCa-P为瘤源的单克隆细胞低转移株G2、B8、HE10和无转移株H5以及以G2、H5、B8、E10为亲本的615小鼠脚垫接种部位移植瘤体外培养细胞为研究对象，观察转移株与无转移株细胞膜磷脂的差异，探讨膜磷脂变化与肿瘤淋巴道转移能力的关系，为肿瘤治疗寻找治疗靶点奠定基础。3.以HCa-P为瘤源的单克隆细胞低转移株G2、B8、E10和无转移株H5以及以G2、H5、B8、E10为亲本的615小鼠脚垫接种部位移植瘤体外培养细胞为研究对象，从药物细胞毒性、生长曲线，群体倍增时间，细胞周期分布等方面观察药物对三组转移力不同的细胞系活细胞株生物学特性的影响，以HPLC技术检测榄香烯和姜黄素与肿瘤细胞作用后细胞膜磷脂的变化,比较两种药物对具有淋巴道不同转移力的小鼠腹水型肝癌细胞系或细胞株的膜磷脂影响的差异，探讨其抗肿瘤的机制，为肿瘤治疗寻找治疗靶点提供实验基础和理论依据。方法：1.以高淋巴道转移系HCa-P/L6和低淋巴道转移系HCa-P、以HCa-P为瘤源的单克隆细胞低转移株HCa-P-G2、HCa-P-B8、HCa-P-E10和无转移株HCa-P-H5以及以HCa-P-G2、HCa-P-H5、HCa-P-B8、HCa-P-E10为亲本的移植瘤细胞为研究对象，以差速离心、梯度离心和液-液萃取方法分离、提取肿瘤细胞膜脂质，以HPLC技术检测细胞膜磷脂。2.采用MTT法测定姜黄素和榄香烯对HCa-P/L6和HCa-P两株细胞的非细胞毒性最大药物剂量；以非细胞毒性最大药物剂量的姜黄素和榄香烯处理两种细胞；绘制各种细胞的生长曲线并计算各自的群体倍增时间；采用流式细胞仪检测姜黄素和榄香烯对两株细胞的细胞周期的影响；用非细胞毒性最大剂量作用于HCa-P/L6和HCa-P以及四株单克隆细胞48h，以HPLC技术检测榄香烯和姜黄素与肿瘤细胞作用后细胞膜磷脂的变化。结果：1.高转移系HCa-P/L6和低转移系HCa-P的PE、PI的吸光值有不同，HCa-P/L6中两种磷脂的含量均高于HCa-P。2.四个细胞株的PC含量无显著差异。低转移株G2、B8、E10之间PE、PI含量无显著差异，G2的PE、PI含量显著高于无转移株H5（t检验P<0.05）。3.给615小鼠脚垫皮下接种单克隆细胞后，G2、B8、E10和H5成瘤率分别为35%、20%、25%和10%；淋巴结转移率分别为G2-25%、B8-10%、E10-10%，H5未发现转移。4.给615小鼠脚垫皮下接种单克隆细胞后,低转移株G2的PC含量低于其他三个细胞株（t检验，P<0.05），H5、B8、E10之间无显著差异；G2、B8、E10之间PE、PI含量无显著差异，G2的PE、PI含量显著高于无转移株H5（t检验，P<0.05）。小鼠脚垫皮下移植瘤的磷脂含量与其相应的单克隆细胞株相比没有明显变化。5.20～100μg/mL的榄香烯作用HCa-P/L6和HCa-P48h后，对两种细胞生长均有明显的抑制作用（P<0.05），且呈量效关系；对HCa-P/L6的抑制范围广于对HCa-P；对HCa-P/L6的IC50为48μg/mL，对HCa-P的IC50为90μg/mL；非细胞毒性最大药物剂量为10μg/mL。10μg/mL榄香烯使HCa-P/L6和HCa-P两个细胞系的群体倍增时间增加，且差异显著（P<0.05）；使细胞周期阻滞于S期，而且对HCa-P/L6的阻滞作用大于对HCa-P；使HCa-P/L6、HCa-P细胞中PE、PI含量减少（t检验，P<0.05），PC含量无显著增加（t检验P﹥0.05）；使单克隆细胞株G2、B8、E10和H5中PE、PI均减少（t检验P<0.01）,G2磷脂含量减少较其他三株明显，PC含量无明显变化；使615小鼠脚垫皮下接种的四株移植瘤体外培养细胞PE、PI均减少（t检验P<0.01），G2细胞用药后磷脂含量减少较其他三株明显，PC含量无明显变化。6.15～250μmol/L的姜黄素作用HCa-P/L6和HCa-P48h后，除15μmol/L以外，其它浓度的姜黄素对两种细胞均有明显的抑制作用（P<0.05），且呈量效关系；对HCa-P/L6的IC50为51.48μmol/L、对HCa-P的IC50为86.48μmol/L；非细胞毒性最大药物剂量为15μmol/L。15μmol/L姜黄素处理细胞48h，可使HCa-P/L6细胞周期聚集于S期，使HCa-P细胞周期聚集于S期和G2/M期；HCa-P/L6和HCa-P中PE、PI两种磷脂含量均减少，且HCa-P/L6较HCa-P减少明显（t检验P<0.01）。单克隆细胞株G2、B8、E10和H5中PE、PI两种磷脂均有减少（t检验P<0.01），而PC含量无明显变化，G2用药后磷脂含量减少较其他三株明显；615小鼠脚垫皮下接种的四株移植瘤体外细胞中PE、PI均有减少（t检验P<0.01），C含量无明显变化。单克隆转移株G2细胞用药后磷脂含量减少较其他三株明显。7.在非细胞毒性最大剂量，榄香烯对细胞膜磷脂的影响较姜黄素明显。脚垫接种传代处理后，细胞对药物的敏感性增加，药物对细胞膜磷脂的影响增加。结论：1.小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移系HCa-P/L6中PE、PI两种磷脂的含量高于低转移系HCa-P；单克隆低转移株G2的PE、PI含量高于无转移株H5；615小鼠脚垫接种原位移植瘤体外培养细胞G2的PE、PI含量含量高于无转移株H5，而且与其亲本单克隆细胞株相比，PE、PI含量增加。结果提示PE、PI含量增高可能与肿瘤转移能力高有关。2.榄香烯呈剂量依赖性抑制HCa-P/L6和HCa-P细胞生长，10μg/mL的榄香烯可使细胞周期重新分布，两细胞系均阻滞于S期，且HCa-P/L6较HCa-P阻滞明显。HCa-P/L6较HCa-P对榄香烯敏感。3.姜黄素呈剂量依赖性抑制HCa-P/L6和HCa-P细胞生长，15μmol/L姜黄素可使细胞周期重新分布，使HCa-P/L6细胞周期聚集于S期，使HCa-P细胞周期聚集于S期和G2/M期，且HCa-P/L6较HCa-P阻滞明显。HCa-P/L6较HCa-P对姜黄素敏感。4.榄香烯和姜黄素均可使具有不同淋巴道转移力的细胞系或细胞株中细胞膜磷脂PE、PI含量减少，且高转移系HCa-P/L6较比低转移系HCa-P减少明显，单克隆转移株G2及其615小鼠脚垫接种移植瘤体外培养细胞PE、PI含量减少均比相应的无转移株H5明显。榄香烯和姜黄素对比，在非细胞毒性最大药物剂量，榄香烯使两个细胞系中PE、PI含量减少更为明显。榄香烯和姜黄素抑制肿瘤生长及转移可能与其使PE、PI含量减少相关。