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冠心病是多因素、多基因、多通路的复杂疾病，其发病机理涵盖多层次生物网络调控过程。血瘀证作为冠心病临床辨证中最常见的证型，其分子机制之一是由于体内相关的miRNA与靶基因之间的消长平衡状态被破坏。 microRNA(MICRORNA或miRNA)是一类非编码小RNA分子，可以导致其靶基因的降解或阻碍其靶基因的翻译。miRNA表达异常引起相应生物网络的紊乱即机体阴阳关系失衡，是疾病发生的重要原因之一。新近研究显示，miRNA是心血管疾病重要调控因子之一，其表达模式在诸多心血管疾病中均发生了改变，如动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压、心律失常及心力衰竭等。miRNA在冠心病中作为生物标志物和治疗靶点的研究已经得到广泛开展[1]，其与冠心病的诊疗和防治均密切相关。但是血瘀证作为冠心病中医临床最常见的证型，目前却仍缺少与其相关的miRNA生物标志物的探索研究，活血化瘀药物干预冠心病血瘀证的miRNA靶点也尚不明确。将miRNA引入冠心病血瘀证相关生物标志物的研究，观察活血化瘀药物血塞通对其的干预影响，证明血塞通可能通过调节相关miRNA与其靶基因之间的消长平衡关系，保持机体内环境稳态从而治疗冠心病血瘀证，为冠心病血瘀证诊断和治疗提供了新的思路和靶标。本课题采用临床研究结合基础研究的方法，在前期试验基础之上探索和验证了冠心病不稳定型心绞痛血瘀证相关miRNAs，用活血化瘀药物血塞通(PNS)进行干预，探索中药治疗冠心病血瘀证可能的分子生物学机制和切入点，期望能为冠心病不稳定型心绞痛血瘀证的诊断提供新的生物标志物，同时为其治疗提供新的靶点。 临床研究 1目的 观察血塞通(PNS)治疗冠心病不稳定型心绞痛血瘀证的临床疗效，观测血塞通对冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者外周血hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-146b-5p及KIR3DS1、HLA-DPB1、TP53、SESN2、NCR1和PRF1表达的影响，从而阐述血塞通治疗冠心病血瘀证可能的分子机制。 2方法 选取心绞痛分级Ⅰ～Ⅲ级的冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者80例，随机分为对照组(n=40)和治疗组(n=40)。对照组给予常规西药治疗+安慰剂，治疗组在常规西药治疗基础上加用血塞通软胶囊，治疗4周。观察治疗前后患者心绞痛分级、中医证候评分、缺血总负荷、西雅图心绞痛质量评分、血浆CRP水平变化，血流动力学和血脂指标变化。qPCR试验检测外周血hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-146b-5p和KIR3DS1、HLA-DPB1、TP53、SESN2、NCR1、PRF1等基因的表达变化，评估血塞通治疗冠心病血瘀证的临床疗效，以及该药物对hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-146b-5p及抗原呈递和处理通路、p53信号通路和NK细胞介导的细毒性通路细胞因子表达的影响。 3结果 3.1对患者心绞痛分级和缺血总负荷的影响 患者心绞痛分级:治疗组总有效率为87.5％，对照组为82.5％，治疗组有效率虽高于对照组，但无统计学意义(P＞0.05)。治疗前后缺血总负荷比较:血塞通治疗4周后，对照组治疗前后差异有统计学意义，P=0.021＜0.05;治疗组治疗前后差异有统计学意义，P=0.013＜0.05;治疗后两组组间比较差异亦有统计学意义，P=0.034＜0.05。 3.2对患者血浆CRP的影响 血浆CRP是冠心病不稳定型心绞痛较特异性的血清检查指标，治疗前后对照组和治疗组患者血浆CRP水平比较可看出对照组治疗前后差异有统计学意义(P＜0.05)，治疗组治疗前后差异有显著的统计学意义(P＜0.01)，疗后对照组与治疗组相比，组间差异也有显著的统计学意义(P＜0.05)。 3.3对患者血流动力学的影响 全血粘度、血浆粘度、血沉、红细胞刚性指数和红细胞聚集指数在治疗组和对照组，治疗前与治疗后对比均具有显著的统计学差异，P＜0.05;纤维蛋白原和红细胞压积在治疗组和对照组，治疗前与治疗后对比没有统计学变化，P＞0.05;治疗后组间比较，全血粘度、血浆粘度、和红细胞刚性指数在两组中有显著的统计学差异，P＜0.05，治疗组优于对照组;而纤维蛋白原、血沉、红细胞聚集指数和红细胞压积在治疗后两组中比较无统计学差异，P＞0.05。 3.4对患者血脂的影响 治疗组和对照组分别行组内比较，TC、TG、HDL-C和LDL-C水平变化有统计学意义，P＜0.05。TC、TG和LDL-C明显下降，而HDL-C明显上升。治疗组和对照组在治疗后组间比较示治疗组各指标改变均优于对照组，其中TC、TG和LDL-C在两组间的差异有统计学意义，P＜0.05; HDL-C的组间差异无统计学意义，P＞0.05。 3.5对患者生活质量的影响 西雅图心绞痛量表评分显示两组治疗后与治疗前比较差异具有显著的统计学意义（P=0.000＜0.01）;疗后治疗组与对照组差异具有统计学意义(P=0.012＜0.05)，治疗组显著优于对照组。 3.6对患者中医证候积分的影响 中医总证候积分比较:两组中医症候积分治疗后较治疗前均有明显改善，差异有显著统计学意义（P=0.000＜0.01）。同时对照组和治疗组治疗后证候积分对比，治疗组改善程度优于对照组，差异有统计学意义（P=0.032＜0.05）。 3.7患者外周血hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-146b-5p及其靶基因KIR3DS1、HLA-DPB1、TP53、SESN2、NCR1和PRF1的qPCR结果 hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p在对照组和治疗组疗后比疗前均有降低;KIR3DS1、HLA-DPB1、TP53、SESN2、NCR1和PRF1在对照组和治疗组疗后比疗前均有升高。其中TP53和hsa-miR-146b-5p在对照组疗后与疗前相比差异有统计学意义，(P＜0.05)。KIR3DS1、TP53、SESN2、PRF1、hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p在治疗组疗后与疗前相比差异有统计学意义，（P＜0.05）。治疗组与对照组疗后相比KIR3DS1、TP53、SESN2、PRF1、hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p表达差异有统计学意义，(P＜0.05)，治疗组优于对照组。提示hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p可能是血塞通治疗冠心病血瘀证的调控靶点，另外可以推测KIR3DS1、TP53、SESN2、PRF1可能是hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p的靶基因，它们也参与了血塞通干预冠心病血瘀证的分子调控环节。 实验研究 1目的 观察血塞通(PNS)对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤模型的影响，通过测定药物对hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5以及对抗原呈递和处理通路、p53信号通路和NK细胞介导的细毒性通路细胞因子的干预效果，对比hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5过表达时相关靶基因的变化趋势和程度，验证hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5可以作为冠心病血瘀证的生物标志物，探索血塞通对氧化损伤模型的作用机制，研究hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5对3条信号通路的调控作用。寻找血塞通治疗冠心病不稳定型心绞痛的有效靶点。 2研究方法 2.1 PNS处理对细胞增殖和细胞活力的影响 HUVEC随机分为12组:即对照组(Control)、H2O2模型组、PNS预处理组（浓度分别为1、3、10、30、100ug/ml，提前24小时干预）、PNS后处理组（浓度分别为1、3、10、30、100ug/ml，氧化损伤后给药）。以100uM H2O2处理4小时为时间零点，在0、24、48、72小时，用CCK8法检测细胞活性。 2.2 hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p的qPCR检测 HUVEC细胞分为空白对照组、H2O2模型组、H2O2模型+PNS(30ug/ml，后处理24h)组，总共3组，以100uM H2O2处理4小时为时间零点，在72小时收集细胞样本。提取总RNA。采用紫外吸收法检测总RNA的纯度和浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。RNA反转录后进行qPCR检测。 2.3 PNS处理对细胞周期和细胞凋亡的影响 HUVEC随机分成3组:即对照组(control)、H2O2模型组和30ug/ml PNS后处理组。PI染色检测细胞周期，流式细胞仪分析细胞周期分布情况;AnnexinⅤ/PI测定细胞凋亡，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。 2.4 miRNA过表达对细胞增殖和细胞活力的影响 HUVEC随机分为6组:即H2O2模型组、H2O2 Model+PNS组、H2O2 Model+miRNA-199组、H2O2 Model+miRNA-146组、H2O2 Model+miRNA-199+PNS组和H2O2 Model+miRNA-146+PNS组。以100uM H2O2处理4小时为时间零点，在72小时，CCK8检测细胞活性。 2.5 miRNA过表达对细胞周期和细胞凋亡的影响 HUVEC随机分成6组:即H2O2模型组(H2O2 Model)，H2O2 Model+PNS组，H2O2 Model+miRNA-199组，H2O2Model+miRNA-146组，H2O2 Model+miRNA-199+PNS组，H2O2 Model+miRNA-146+PNS组。PI染色检测细胞周期，流式细胞仪分析细胞周期分布情况;AnnexinⅤ/PI测定细胞凋亡，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。 2.6 hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p过表达的qPCR检测 HUVEC细胞分为H2O2模型组，H2O2 Model+PNS组，H2O2 Model+miRNA-199组，H2O2Model+miRNA-146组，H2O2 Model+miRNA-199+PNS组，H2O2 Model+miRNA-146+PNS组，总共6组，在-24小时，以每孔5pmol的量转染miRNA mimics，以100uM H2O2处理4小时为时间零点，在72小时，收集细胞样本。提取总RNA。采用紫外吸收法检测总RNA的纯度和浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。RNA反转录后进行qPCR检测。 2.7 Western Blot对目的蛋白表达变化的检测 HUVEC细胞分为H2O2模型组，H2O2 Model+PNS组，H2O2 Model+miRNA-199组，H2O2Model+miRNA-146组，H2O2 Model+miRNA-199+PNS组，H2O2 Model+miRNA-146+PNS组，总共6组。制备蛋白样品，BCA法测定蛋白含量，进行Western Blot检测。 2.8统计方法 所有数据用均数±标准差表示，数据分析采用SPSS16.0统计软件，用方差分析(analysis of variance，ANOVA)比较不同条件下的组间差异，P＜0.05具有统计学意义。 3结果 3.1 PNS处理对细胞增殖和细胞活力的影响 实验结果显示100uM H2O2处理可以明显抑制HUVEC细胞的增殖。随着浓度的增加，当药物浓度达到10ug/ml和100ug/ml之间的时候，能显著对抗细胞氧化损伤，在药物浓度为30ug/ml的时候，细胞增殖改善达到顶峰，因此推断药物最佳浓度为30ug/ml，为后续实验奠定了基础。 3.2 hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p的qPCR检测结果 对两个microRNA hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p进行荧光定量PCR的结果可知，100uM的H2O2处理可以明显的升高hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p的表达，其中hsa-mir-146b-5p大约升高2.3倍，hsa-mir-199a-5p的表达大约能升高4倍;与氧化损伤模型组比较，PNS30ug/ml处理组中hsa-mir-146b-5p的表达显著降低，但是PNS30ug/ml对hsa-mir-199a-5p并未表现出明显的干预作用。 3.3 PNS处理对细胞周期和细胞凋亡影响 从细胞周期结果可以看出，100uM的H2O2可以明显抑制HUVEC细胞的增殖;与此同时30ug/ml PNS干预氧化损伤的HUVEC，可以改善H2O2对细胞周期的抑制，G2-M期具有明显的升高。从AnnexinⅤ/PI双染的细胞凋亡检测可以发现，100uM的H2O2处理之后，细胞的PI阳性率R3（晚期凋亡）和AnnexinⅤ阳性率R5（早期凋亡）都有明显升高;30ug/ml的PNS可以明显的降低氧化损伤HUVEC细胞的PI阳性率，（晚期凋亡）和AnnexinⅤ阳性率R5（早期凋亡）。 综合上述实验结果可知，PNS可以明显的抵抗H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤，可能是通过抑制hsa-mir-146b-5p的升高来产生其保护作用的。 3.4 miRNA过表达对细胞增殖和细胞活力的影响 单纯的hsa-mir146b-5p过表达可以轻度促进H2O2处理对HUVEC造成的氧化损伤，单纯的hsa-mir199a-5p并无明显的作用，同时hsa-mir146b-5p过表达可以部分抵消血塞通(PNS)抵抗氧化损伤的作用。 3.5 miRNA过表达对细胞周期和细胞凋亡的影响 从细胞周期的数据中可以看出，在100uM的H2O2处理中，从G0-G1期hsa-mir-146b-5p的过表达可以明显促进H2O2的氧化损伤作用，更加严重的抑制HUVEC细胞的增殖，而hsa-mir-199a-5p的过表达则对细胞氧化损伤无明显的促进作用;在血塞通(PNS)抵抗氧化损伤模型下，hsa-mir-146b-5p的过表达在G0-G1期中均可以很明显的抵消血塞通(PNS)的保护作用，将G0-G1期恢复到正常损伤水平。在S和G2-M期可以看到，hsa-mir-146b-5p的过表达可以降低S和G2-M这两类细胞增殖期的总比例。而hsa-mir-199a-5p的过表达，虽然对S和G2-M这两类细胞增殖期的总比例并无明显影响，但是也能通过减少S期细胞的比例，将细胞更多的转化到G2-M期，这也意味着hsa-mir-199a-5p对细胞的增殖有一定程度的调控。 3.6 hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p过表达的qPCR检测结果 ①PNS干预和hsa-mir-199a-5p的过表可以明显促进氧化损伤后KIR3DS1表达的升高，P＜0.05; hsa-mir-146b-5p的过表达，对于氧化损伤下的KIR3DS1表达无明显影响，P＞0.05;②PNS对于氧化损伤下的HLA-DPB1表达并无明显的影响，P＞0.05，hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p的过表达可以轻微抑制HLA-DPB1的表达，P＞0.05。③PNS可以明显促进氧化损伤情况下TP53表达的升高，P＜0.05。同时hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p的过表达，对于氧化损伤下的TP53表达无明显影响，P＞0.05。④PNS处理可以明显促进氧化损伤下SESN2表达的升高，P＜0.05。hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p的过表达对于氧化损伤下的SESN2表达无明显影响，P＞0.05。⑤PNS处理和hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-199a-5p过表达对于NCR1的表达均没有明显的影响，P＞0.05。⑥PNS处理可以明显促进氧化损伤后PRF1表达的升高，P＜0.05。hsa-mir-146b-5p的过表达对于氧化损伤下的PRF1表达无明显影响，P＞0.05。但是hsa-mir-199a-5p的过表达则可以明显的升高氧化损伤下的PRF1表达，P＜0.05。 3.7 hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p过表达的WB检测结果 与hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-199a-5p过表达的qPCR检测结果一致。 4结论 4.1临床观察发现血塞通可以有效改善冠心病血瘀证患者缺血总负荷、血浆CRP、血流动力学、血脂指标及生活质量。 4.2患者外周血qPCR检测发现，治疗组疗后miRNA较对照组疗后表达下降，靶基因表达较对照组明显升高，具有统计学意义，P＜0.05。验证了hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p可以作为冠心病血瘀证相关生物标志物。 4.3血塞通可以有效降低hsa-miR-146b-5的表达，但是对hsa-miR-199a-5p无明显的干预作用，从而判断hsa-miR-146b-5p是血塞通治疗冠心病血瘀证的有效靶点。 4.4 KIR3DS1、HLA-DPB1、TP53、SESN2、NCR1以及PRF1的表达在血塞通药物干预下均有所下降，在hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5过表达时明显升高，但是除了TP53外，其他细胞因子并不受hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5直接调控。 4.5 hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-146b-5p可能通过作用于抗原呈递和处理通路、p53信号通路和NK细胞介导的细毒性通路从而干预冠心病血瘀证的分子机制。