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脂滴是一种重要的细胞器,由中性脂质核和磷脂单层膜构成,并存在于绝大部分的真核细胞中。脂滴在不同细胞中尺寸不同,脂肪细胞中大的脂滴尺寸可达200μm,小的新生脂滴尺寸只有30-60 nm。脂滴在细胞内参与多种生理过程,其功能失调与多种疾病相关,因此,脂滴研究对于多种疾病的病因产生和预防具有重要意义。荧光成像技术是研究脂滴多种多样功能最有力的工具之一。荧光成像技术包含两个重要因素,分别是荧光探针和荧光显微镜。传统的荧光显微镜由于受到衍射极限的限制,分辨率极限在200 nm左右。而各种超分辨荧光显微镜可以打破光学衍射极限,实现200 nm以下的分辨率。2014年的诺贝尔化学奖之所以颁给三位物理学家,就是因为他们通过不同的方法利用荧光探针巧妙地避开了光学衍射极限,用光学显微镜实现了纳米量级的分辨率。就物理本身而言,已经没有了根本性的限制,它们的技术核心就是调整荧光探针的发光特性,实现亮与暗之间的转换。究其根本,本来纯粹的物理问题演变成了如何合成具有荧光开关属性的荧光探针化学问题。本论文旨在通过合理的分子设计,调节有机小分子荧光探针的发光特性,开发能够满足不同荧光显微镜需求的脂滴荧光探针,并利用先进的受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion,STED）超分辨成像技术,清晰地观察细胞中脂滴的空间分布,在纳米尺度精准追踪细胞内脂滴的动力学过程,了解脂滴在细胞中的活动规律,为脂滴的细胞生物学研究提供强有力的工具。具体内容如下:1.为了解决现有商用脂滴荧光探针染色选择性不足的问题,开发了一种全新的基于单苯环骨架的脂滴荧光探针Ph-Red。该探针分子结构简单、合成容易、更重要的是它基于单苯环这种小的共轭骨架就能展现出高效的红光发射。而红光发射对于荧光探针来说具有较大的优势,其可以有效降低细胞内蓝光区域背景信号的干扰。荧光探针Ph-Red具有高的脂滴染色选择性和良好的生物相容性,可以进行重复性的荧光成像。由于具有上述优势,将荧光探针Ph-Red用于脂滴荧光成像,成功地实现了固定细胞的3D共聚焦成像和活细胞的多色共聚焦成像,突出了Ph-Red在脂滴荧光成像中的实用性。此外,发现合适的亲疏水性以及分子结构大小是荧光探针高效染色细胞脂滴的关键因素。这对于开发新型脂滴荧光探针具有重要的启示意义。2.为了解决脂滴超分辨成像荧光探针光稳定性不足的问题,开发了一种基于均二苯乙烯衍生物的脂滴超分辨成像荧光探针Lipi-DSB。该探针通过在均二苯乙烯骨架两端及中间部分分别引入吸电子的氰基和给电子的氨基,这样得到的给受体结构的Lipi-DSB在具有较高荧光亮度的同时,保证了较大的斯托克斯位移。氰基的引入有效降低了LUMO能级,显著提高了Lipi-DSB的光稳定性,氨基的引入则可以调节Lipi-DSB的选择性。此外,该探针还具有较低的STED激光饱和强度以及良好的生物相容性。基于上述优异的性质,将荧光探针Lipi-DSB用于脂滴的STED超分辨荧光成像,得到了当时最高水平的脂滴超分辨成像结果:1)最高的脂滴超分辨成像分辨率58 nm;2)最多张数（1000张）的活细胞中脂滴延时STED超分辨成像;3)首次观察到新生脂滴的融合过程;4)最高质量的脂滴3D STED超分辨成像。因此,以前所未有的纳米尺度分辨率观察到了细胞内脂滴的空间分布,追踪了脂滴在细胞内的动力学过程,突出了荧光探针Lipi-DSB在脂滴STED超分辨荧光成像中的实用性。3.为了进一步提升脂滴STED超分辨成像效果,实现利用荧光探针对饥饿状态下细胞内脂滴动力学追踪的生物应用,开发了一种基于喹吖啶酮衍生物的具有较长荧光寿命（20 ns左右）的荧光探针C2-t Bu QA。长荧光寿命对于提升STED超分辨成像分辨率至关重要:它一方面可以有效降低荧光探针的饱和强度,另一方面允许使用时间门控检测的方式进一步提升成像分辨率。在荧光探针的设计上选取具有较长荧光寿命的喹吖啶酮骨架,通过在其分子骨架上分别引入叔丁基和烷基链,提升荧光探针溶解性以及调节亲疏水性,通过取代掉活性反应位点上的H原子有效提升荧光探针的光稳定性。制得的荧光探针C2-t Bu QA展现出了较高的荧光亮度、良好的生物相容性以及较高的脂滴染色选择性。鉴于上述优点,将C2-t Bu QA用于脂滴的STED超分辨成像,脂滴超分辨成像的最高分辨率从58 nm显著提升到了37 nm,远远地低于光学衍射极限。同时,在纳米尺度上以最高的动态成像分辨率（38 nm）长期精准地追踪了脂滴的动力学过程（可拍摄500张STED超分辨照片）。首次监测到了纳米尺度的脂滴分离过程。更重要的是实现了荧光探针C2-t Bu QA的生物应用:利用4D共聚焦成像和双色STED超分辨成像,成功地掌握了不同饥饿状态下He La细胞中脂滴数量和尺寸的变化规律,为脂滴的细胞生物学研究提供了有力的工具,促进了脂滴细胞生物学的发展。综上所述,本论文开发了3种全新的有机小分子脂滴荧光探针,解决了现有脂滴荧光探针染色选择性不足以及脂滴超分辨成像荧光探针严重缺失的问题,实现了最高的脂滴超分辨成像分辨率和长期精准的脂滴动态追踪,并且还成功地实现了荧光探针的生物应用。这三个有机小分子脂滴荧光探针的开发为脂滴的细胞生物学研究提供了新的视野,促进了脂滴细胞生物学走向更深层次的研究。