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本研究开展PCV2杆状病毒载体表达的Cap蛋白抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌4型和5型抗原制备工艺优化,并确定三联灭活疫苗中各种抗原的最小使用量;进一步开展疫苗安全性和有效性评价,并完成与同类相关产品免疫持续期抗体比较研究。确定PCV2 Cap蛋白制备工艺为:Sf9细胞初始密度3.0×106～4.0×106个/m L,MOI=1.0～5.0,27℃,转速35～50r/min,溶氧30～50%,培养96～120小时,Cap蛋白表达最优;使用终浓度为0.1%的BEI 37℃灭活24小时;灭活病毒液经3～6μm滤板澄清,经50KD膜包浓缩3～4倍,再经层析柱纯化,抗原回收率85%以上,纯度90%以上。测定蛋白浓度后用于疫苗制备。确定猪肺炎支原体菌体抗原制备工艺为:接种量为8%～10%;静置培养,37℃培养4～5日,p H值降至6.8左右收获菌液;发酵罐培养,以50r/min、通氧量10%～20%、37℃培养3～4日,p H值降至6.8左右收获菌液;使用终浓度为0.1%的BEI 37℃灭活24小时;灭活菌液经50KD超滤膜包浓缩10倍,再经4℃10000r/min离心60分钟,收集菌泥沉淀,用PBS（0.01mol/L,p H 7.2）恢复至原体积的1/100,超声5分钟。测定蛋白浓度后用于疫苗制备。确定副猪嗜血杆菌4型RPBS0904-11株发酵工艺为:37℃、p H值为7.0、接种比例为1%,控制通气流速和搅拌速度,溶氧20%以上,选择在8、10、12、14小时进行4次5%体积的流加补料,在16小时收获菌液;确定副猪嗜血杆菌5型RPBS0905-3菌株发酵工艺:37℃、p H值为7.0、接种比例1%,控制通气流速和搅拌速度,溶氧20%以上,选择在6、8、10、12小时进行4次5%体积的流加补料,在14小时收获菌液;采用终浓度0.3%甲醛溶液37℃灭活24小时;灭活菌液采用0.1μm中空纤维柱10倍浓缩,再以4℃6000r/min离心20分钟,沉淀菌体用PBS（0.01mol/L,p H 7.2）重悬至适宜浓度后用于疫苗制备。通过对不同抗原含量疫苗的攻毒保护效果评价,确定制苗标准为:Cap蛋白50μg/头份,Mhp抗原100μg/头份,HPS 4型抗原4.0×109CFU/头份和HPS 5型抗原2.0×109CFU/头份。在安全性检验中,免疫猪精神、采食、呼吸、粪便和行为均未见异常,与对照猪无显著差异,体温呈一过性升高反应,未见局部和全身不良反应。在血清抗体监测中,免疫组PCV2 ELISA抗体、Mhp ELISA抗体、HPS 4型和5型MAT抗体全部转阳。在攻毒保护试验中,免疫猪均获得80%以上的保护率或肺炎病变减少率60%以上。与市售相关产品免疫抗体持续期无明显差异。该疫苗为行业首次报道,免疫保护覆盖范围广,可达到一针同时防控三种影响生猪产业的主要疫病,将弥补该产品在国内的空缺。