论文部分内容阅读
背景牙齿的发育是一个牙源性上皮与间充质相互诱导、相互作用的复杂的生物学过程。在牙源性上皮的诱导下,牙源性间充质进一步分化形成牙本质和牙髓,而牙源性上皮也在牙源性间充质的诱导下发育形成成釉器。所以,牙源性上皮在牙齿的形态发生和发育成熟中发挥着重要的作用。目前应用于组织工程的干细胞主要有两种即胚胎干细胞和成体干细胞。但由于胚胎干细胞的应用受伦理学方面影响,所以组织工程种子细胞只能从成体干细胞方面考虑。脂肪来源的干细胞是成体干细胞的一种,具有所有干细胞的特性,体外培养有多项分化的能力,可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞及神经细胞。与其它成体干细胞相比脂肪来源的干细胞具有取材容易,获得率高,对组织损伤小等特点,故在组织工程中有着重要的位置,是一种良好的种子细胞。目的本研究旨在通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apical bud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源的干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法1.大鼠Apical bud上皮细胞的培养与鉴定取出生后4 d大鼠仔鼠切牙的Apical bud组织,采用酶消化法和差别消化法原代培养获得大鼠切牙的Apical bud上皮细胞,并通过免疫组织化学染色检测CK14、抗釉原蛋白、抗波形丝蛋白。2.大鼠脂肪来源干细胞的培养及多向分化能力探讨取出生后4 d的大鼠腹股沟处的脂肪组织,酶消化法原代培养获得脂肪来源的干细胞。油红O染色鉴定成脂诱导;茜素红染色鉴定成骨诱导;神经细胞分子标志神经元特异性烯醇化酶、S100蛋白免疫细胞化学染色鉴定成神经诱导。3.大鼠切牙Apical bud上皮诱导脂肪干细胞(ADSCs)成牙本质样分化实验3.1体外实验:生长良好的第三代大鼠脂肪来源干细胞,培养于Apical bud上皮细胞的条件培养液中,观察细胞的生长和形态变化。诱导7 d后,采用免疫组化法检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达,RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1)的表达。3.2体内实验:取生长良好的第三代脂肪来源的干细胞,加入5%胎牛血清的DMEM/F12培养液,制成细胞悬液,将分离好的Apical bud上皮放入悬液中,离心获得重组细胞团,加入20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,在37℃,5% CO2饱和湿度条件下过夜培养。次日将重组细胞团植入大鼠肾被膜下。8周后肾被膜下取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果1.大鼠Apical bud上皮细胞:酶消化法获得的原代上皮细胞为混杂细胞,呈长梭状的细胞为成纤维样细胞,呈多角形的是上皮样细胞,上皮样细胞被成纤维样细胞包绕,呈“岛”样分布。经过2至3次差别消化,成纤维样的细胞被完全去除,贴壁细胞全部为上皮样细胞。免疫组化检测CK14表达阳性;釉原蛋白表达阳性;抗波形丝蛋白表达阴性。2.大鼠脂肪来源干细胞:原代细胞呈小多角形或短梭形,单核,有时突起较多,并存在一些多脂滴细胞,经传代后多脂滴细胞减少,脂肪干细胞突起减少,呈小多角形或短梭形,生长较快,在传代过程中未见形成自发钙结节,也未见到向成熟脂肪细胞。成脂诱导后,油红O染色可见成红色的脂滴颗粒,证实ADSCs成脂分化。成骨诱导中,茜素红染色可见呈橘红色钙盐沉积,证实ADSCs成骨分化。脂肪来源的干细胞向成神经方向诱导的过程中,神经元特异性烯醇化酶、S100蛋白染色均为阳性结果,证实ADSCs成神经分化。3.体外诱导实验结果: Apical bud上皮细胞的条件培养液可诱导脂肪来源干细胞发生形态学变化,均可见细胞变长,并出现极性改变,细胞呈平行排列的趋势。免疫组化均可见DSPP呈阳性染色。RT-PCR检测显示DSPP和DMP-1表达。4.体内诱导实验结果:Apical bud上皮细胞和脂肪来源干细胞重组体肾被膜下生成物的HE染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构;Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构;免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论1.采用酶消化法和差别消化法能够原代培养获得大鼠切牙的Apical bud上皮细胞;2.采用酶消化法能够原代培养获得大鼠脂肪来源干细胞,并证实其具有多向分化能力;3. Apical bud上皮细胞在体外能够诱导脂肪来源的干细胞向成牙本质细胞分化;4. Apical bud上皮与脂肪来源的干细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。