7株小鹅瘟病毒的分离鉴定、克隆与序列分析

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本研究的7株病毒是从广东、四川、东北三省患病鹅的小肠组织中分离的,初步鉴定为小鹅瘟病毒(Gooseparvovirus,GPV),分别命名为QY/05、SC/05、DB/01/05、FS/05、ZH/05、DB/02/05、DB/03/05后,对7株病毒的生物学特性进行了鉴定。病料经过处理后,接种12日龄非免疫鹅胚,传代,发现病毒对鹅胚的平均致死时间为3~4天,胚体全身出现较为严重的出血点。病毒接种鹅成纤维细胞和番鸭成纤维细胞,显微镜下可见细胞圆缩、脱落、折光性增强等明显的细胞病变。鹅胚尿囊液经梯度离心后,磷钨酸负染,电镜下可见明显细小的病毒样粒子。7株小鹅瘟病毒尿囊液对鹅胚的EID50分别为10-3.67/0.3ml、10-2.25/0.3ml、10-2.91/0.3ml、10-3.53/0.3ml、10-4.02/0.3ml、10-3.05/0.3ml、10-4.27/0.3ml。对细胞的TCID50分别为2-5.425/0.1ml、2-4.92/0.1ml、2-5.21/0.1ml、2-4.98/0.1ml、2-5.341/0.1ml、2-4.01/0.1ml、2-6.04/0.1ml。感染一个病毒最小致死量的鹅胚平均死亡时间(MDT)分别为96h、108h、138h、120h、84h、144h、100h。将32只12日龄雏鹅随机分为7个实验组和1个生理盐水对照组。每组接种100EID50鹅胚尿囊液,发现雏鹅接种病毒后2天即出现不同程度的腹泻,食欲不振。采集肛门拭子,用聚合链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)检测各组雏鹅排毒情况,发现7个实验组在接种病毒1~20天内均可以检测到病毒,对照组则始终不能检测到病毒。同时本研究建立了PCR诊断方法,筛选了最佳反应条件,并进行了敏感性、特异性和重复性实验。结果表明,在25μL体积中,PCR最佳系统组成为1.25UEX-TaqDNA聚合酶、1μLdNTPs(2.5mmol/L)、和25pmol引物;最佳反应参数为94℃3min预变性,然后94℃变性1min,53℃退火50s,72℃延伸50s,30个循环,最后72℃后延伸8min。 本研究根据国外已发表的GPV基因序列,设计并合成了三对引物,三对引物扩增长度覆盖全长的NS(Non-structure)基因和VP基因,扩增长度分别为1495bp、1336bp、1382bp。克隆序列测定,拼接后,得到7株GPV分离株的非结构基因和结构基因。与国内外部分发表的毒株的对应序列比较,同时与番鸭细小病毒(MuscovyDuckparvovirus,MDPV)比较结果表明:本研究的7株GPV的NS基因长度全部为1884bp,编码627个氨基酸,有4个糖基化位点。编码的氨基酸序列中都含有保守“P环”结构域,即GPATTGKT序列,这是GPVNS1中最保守的序列。结构基因VP长为2199bp,编码732个氨基酸。5个糖基化位点全部位于结构基因的VP3片段。分离的7株毒株中有5株即毒株QY/05、SC/05、FS/05、ZH/05、DB/03/05符合强毒株的分子特征,即在VP3基因的797位G,1141位A,1144位G,1169位C,1185位T。另外两个毒株则在这些位置分别为A,G,A,A,A,符合弱毒株的分子特征。进化树分析表明,7株GPV与国内外的GPV毒株均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。并且与番鸭细小病毒的亲缘关系比较接近。
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