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缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国重要的经济贝类之一，探索生长相关基因功能具有重要的生产实践意义。本实验从缢蛏转录组文库中筛选获得一条表皮生长因子受体的部分序列，通过RACE法获得了EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR) 基因的cDNA全长序列，并发现一处可变剪切现象。本文分析了两个亚型时空表达的特征，对比了其在体外对细胞增殖的能力，并初步探索了缢蛏EGFR基因在个体生长过程中的功能。 1. 缢蛏EGFR基因的克隆及基因结构分析 经Race法得到缢蛏EGFR基因的cDNA全长片段，命名为Sc-EGFR，同时在cDNA片段中发现了两个亚型，分别命名为Sc-EGFR-1a (登录号：MF958947)和Sc-EGFR-1b(登录号：MF958948)。序列分析表明，Sc-EGFR-1a基因的全长为5,962bp，开放阅读框可编码1,527个氨基酸，5’端为1,152bp，3’端为226bp，理论分子量是176.33kDa，等电点为5.69。其中Sc-EGFR-1b基因的理论分子量是168.37kDa，等电点为5.70。Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b基因的功能结构域一致，包括胞外区、跨膜区和胞内区。在C端尾处，Sc-EGFR-1a比Sc-EGFR-1b多了27个氨基酸，改变了磷酸化位点，可能影响下游激酶活性。 2. 缢蛏Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b基因的表达分析 采用荧光定量PCR技术检测了Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b基因在不同的发育时期和组织间的表达谱。发现突变体在受精卵时期就存在，并且在幼虫发育的中后期，表达呈上升趋势。在组织间，Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b基因在组织间表达广泛并在水管中的表达量最高。Sc-EGFR-1a基因在斧足、肠和肝脏中的表达量较高，而Sc-EGFR-1b基因在肝脏、鳃和血中有较高表达。 3. 缢蛏Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b基因对细胞增殖能力的初探 在体外实验中，通过增殖细胞核抗原含量(PCNA)和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法，发现Sc-EGFR-1a和Sc-EGFR-1b对细胞增殖能力可能不同。与比对照组相比，转染Sc-EGFR-1a细胞中PCNA的表达量显著高，而转染Sc-EGFR-1a细胞中PCNA的表达量与对照组差异不显著。同时，通过MTT法检测转染后细胞数量的变化趋势，也发现转染Sc-EGFR-1a后细胞的增殖量比对照组多。 4. 体内干扰缢蛏EGFR基因对个体生长影响的初探 在体内RNA干扰实验中，通过荧光定量技术检测EGFR基因干扰效果，发现与对照组相比，斧足内基因的表达量在第2天开始下降，并在第5天至第15天内显著下降。表明，Sc-EGFR dsRNA在15天内能有效干扰基因的表达量。干扰组缢蛏壳长积累的速度比对照组慢，且存活情况也低于对照组。 5. 缢蛏EGFR基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)与生长性状的相关性的分析 本实验利用直接测序法从缢蛏EGFR基因的第一个内含子序列中共筛选到17个SNP位点(命名为SNP 1-17:T785A、A911C、G966A、G996A、A1068G、G1092A、A1125T、T1193A、T1207G、G1262A、T1281A、C1293T、C1301A、C1314T、T1328C、A1359T、C1371G)。卡方检验结果发现，在17个位点当中，有13个位点符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，位点多态性检测显示17个位点当中有10个位点表现为中等多态性(0.25＜PIC＜0.5)。利用General Linear Model(GLM)及多重比较对缢蛏EGFR基因中17个SNPs的多态性与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体重) 进行相关性分析，研究发现除了SNP 7位点以外，其他位点均与缢蛏的壳长、壳宽、壳高及体重呈显著性相关。