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背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种最常见的原发性肝癌。在90%的病例中,HCC通常是在慢性肝硬化或疾病的背景下发生的。在中国,HCC患者5年的总生存率（Overall survival,OS）低于13%。HCC起病较隐匿,在HCC早期几乎不出现明显症状,大部分HCC被诊断为晚期,而且对晚期HCC没有治愈性治疗,其原因可能是肝癌细胞调高了对抗肿瘤药物的耐药性。因此,为了尽可能的提高对HCC的治疗效果和改善预后,HCC的诊断和分期则显得尤其重要。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）是肝癌细胞在外界刺激下而被激发的一种状态,同时也可能是肝癌细胞耐药的原因。葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulatory protein 78,GRP78）/Bi P是一种多功能蛋白,也是内质网应激的标志蛋白。GRP78在肝癌细胞中的表达水平可在很大程度上代表肝癌细胞内的内质网应激水平。SP94（SFSIIHTPILPL）是一种与HCC特异结合的多肽,其偶联的聚合物对HCC的亲和力比对正常肝细胞的亲和力高104倍。这意味着我们可以针对GRP78蛋白设计出相应的靶向性分子探针并通过影像学分析肝癌细胞内内质网应激水平,从而评估内质网应激对肝癌治疗疗效的影响。目的GRP78在多种实体瘤中过量表达,是肿瘤成像或治疗的一个特征明确的目标,也是内质网应激的标志。研究开发一种新型的GRP78反应性放射性示踪剂（[68Ga]SP94）,通过微型正电子发射型计算机断层显像（Micro-positron emission tomography,Micro-PET）评估其在HCC中监测GRP78表达水平的性能并分析内质网应激对肿瘤细胞耐药性的影响。方法1.细胞及探针测试实验1.1 Western blotting技术检测GRP78在HCC细胞和人正常肝细胞的表达1.2 Annexin V-FITC/PI、Western blottin检测内质网应激对仑伐替尼（Lenvatinib）诱导的Hep G2细胞凋亡性的抵抗。1.3 Western blotting分析内质网应激与GPR78表达水平的关系并评估仑伐替尼对GPR78表达水平的影响1.4固相合成法合成标记前体DOTA-SP94,并用68Ga Cl3进行放射性标记获得[68Ga]SP94分子探针。1.5用放射性高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,radio-HPLC）鉴定并计算[68Ga]SP94分子探针的放化纯度。1.6测试[68Ga]SP94分子探针在PBS溶液、生理盐水、5%HAS溶液和小鼠血清中的稳定性并进行Radio-HPLC分析。1.7γ计数仪测定计算[68Ga]SP94分子探针在正辛醇/PBS缓冲液中的脂水分配系数Log P;1.8γ计数仪测定[68Ga]SP94分别与Hep G2和LO2细胞孵育后的细胞摄取率。2.动物实验2.1[68Ga]SP94的药代动力学试验检测[68Ga]SP94在Hep G2肿瘤的小鼠的血液中的不同时间点的浓度以及清除速率。2.2[68Ga]SP94的Micro-PET显像测试携带体积约为250 mm3的Hep G2肿瘤的小鼠随机分为两组,每组各4只。实验组小鼠仅注射[68Ga]SP94,对照组小鼠注射[68Ga]SP94及其阻断剂（DOTA-SP94）,通过Micro-PET显像和生物分布试验评估[68Ga]SP94靶向GRP78高表达的Hep G2细胞的能力并分析其在肿瘤组织、心、肝、脾、肾、肺、肠、胰腺和肌肉不同时间点的分布情况,结果以每克注射剂量的百分比（ID%/g）表示。检测在不同时间实验组和对照组中的[68Ga]SP94在肿瘤和肌肉中摄取量的比值（T/M）、在肿瘤和血液中摄取量的比值（T/B）以来进一步评估[68Ga]SP94对Hep G2细胞的靶向性以及[68Ga]SP94的信噪比。2.3[68Ga]SP94的Micro-PET显像评估仑伐替尼疗效试验携带体积约为250 mm3的Hep G2荷瘤小鼠随机分为治疗组和非治疗组。衣霉素（Tunicamycin）被用作于内质网应激诱导剂。治疗组分为仑伐替尼组和（衣霉素+仑伐替尼）组,非治疗组为对照组和衣霉素组,每组5只小鼠。治疗组和非治疗组的Hep G2荷瘤小鼠在摄入仑伐替尼或衣霉素的第7天和第14天采用[68Ga]SP94进行Micro-PET显像,检测肿瘤组织对[68Ga]SP94的摄取量进行定量分析并评估各组小鼠的肿瘤组织的GRP78表达水平。摄取量结果以（ID%/g）表示。测量治疗组和非治疗组的Hep G2荷瘤小鼠从第0天到第14天的肿瘤体积与[68Ga]SP94的摄取量比较分析并计算抑瘤率,评估[68Ga]SP94的摄取量对仑伐替尼治疗疗效的评估。2.4 Western blotting检测14天后治疗组和非治疗组的Hep G2荷瘤小鼠的肿瘤组织的GRP78、凋亡相关蛋白（bax）和抗凋亡相关蛋白（bcl-2）的表达水平并与[68Ga]SP94的摄取量比较,分析之间的联系来探索[68Ga]SP94评估内质网应激对仑伐替尼药物敏感性的影响。2.5免疫组织化学技术检测14天后治疗组和非治疗组的Hep G2荷瘤小鼠的肿瘤组织的GRP78、P53、VEGF和Glut-1的表达水平并与[68Ga]SP94的摄取量比较,分析之间的联系。结果1.细胞及探针测试实验1.1 Western blotting检测GRP78在HCC细胞表达明显高于在人正常肝细胞的表达。1.2流式细胞术显示的细胞凋亡率以及western blotting显示的抗凋亡蛋白和凋亡蛋白的表达结果显示内质网应激对仑伐替尼诱导的Hep G2细胞凋亡有明显的抵抗性。1.3 Western blotting结果显示内质网应激会显著提高GPR78表达水平。仑伐替尼会在一定程度上提高Hep G2细胞的GPR78表达水平,但会抑制内质网应激的效果。1.4固相合成法合成标记前体DOTA-SP94,并用68Ga Cl3进行放射性标记获得了[68Ga]SP94分子探针。1.5 Radio-HPLC鉴定并计算[68Ga]SP94分子探针的放化纯度＞99%,放化纯度良好,产率高,非常适用于Micro-PET显像。1.6[68Ga]SP94分子探针在PBS溶液、生理盐水、5%HAS溶液和小鼠血清中无明显解离或分解,表明[68Ga]SP94在体内和体外的稳定性良好。1.7[68Ga]SP94分子探针在正辛醇/PBS缓冲液中的脂水分配系数为2.36±0.002;表明[68Ga]SP94有较高的亲水性。1.8在各个时间点Hep G2细胞对[68Ga]SP94的摄取量明显高于LO2细胞对[68Ga]SP94的摄取量,且Hep G2细胞对[68Ga]SP94的摄取速率也明显大于LO2细胞对[68Ga]SP94的摄取速率。细胞结合亲和力测定的结果显示Hep G2细胞对[68Ga]SP94有较高的亲和力。2.动物实验2.1[68Ga]SP94的药代动力学研究表明,[68Ga]SP94能快速分布到组织和器官,并能快速从血液中清除。2.2[68Ga]SP94的Micro-PET显像测试实验组Hep G2荷瘤小鼠（即只注射了[68Ga]SP94）在注射后0.5小时的时间内观察到较高的肿瘤摄取[68Ga]SP94,然后逐渐减弱。相反,对照组小鼠（即同时注射了[68Ga]SP94和DOTA-SP94）,在整个扫描过程中,放射性示踪剂都集中在肾脏中,肿瘤组织几乎观察不到,这表明[68Ga]SP94对GRP78的特异性靶向能力。生物分布实验结果显示[68Ga]SP94的摄取量在注射后0.5小时达到最大值3.53±0.447%ID/g,然后慢慢从肿瘤中清除。[68Ga]SP94在肾脏中显示出最高的摄取量,表明其大部分主要通过泌尿系统排泄。同时,在肝脏中观察到轻微的[68Ga]SP9摄取,表明它的一小部分被肝脏代谢。实验组的（T/B）和（T/M）在0.5h时分别为1.75±0.235和4.40±1.690,1h时为1.49±0.207和4.41±0.803,2h时为1.41±0.155和3.96±0.497,表明该探针在Hep G2肿瘤中具有良好的信噪比。2.3[68Ga]SP94的Micro-PET显像评估仑伐替尼疗效试验Micro-PET显像结果显示在0天,7天和14天非治疗组中的衣霉素组中的肿瘤对[68Ga]SP94的摄取量明显高于对照组。在治疗组内仑伐替尼组对[68Ga]SP94的摄取量低于（衣霉素+仑伐替尼）组。这些结果与各组肿瘤组织以及体外Hep G2细胞的GRP78的表达水平呈一致趋势。治疗组的肿瘤体积远小于非治疗组,同时治疗组中的（衣霉素+仑伐替尼）组肿瘤体积均大于仑伐替尼组。仑伐替尼组抑瘤率与对照组和衣霉素组相比分别在第7天为62.95%,在第14天为70.22%（表3）,且均大于仑伐替尼+衣霉素组。2.4 Western blotting检测结果显示治疗组的Bcl-2/Bax远小于非治疗组。治疗组中的（衣霉素+仑伐替尼）组的Bcl-2/Bax大于仑伐替尼组。2.5免疫组织化学技术检测结果显示P53,VEGF以及GLUT-1在治疗组中肿瘤组织的表达均远低于非治疗组。在治疗组中,P53,VEGF以及GLUT-1在仑伐替尼组中的表达低于（衣霉素+仑伐替尼）组。结论本研究开发出的[68Ga]SP94分子探针对GRP78蛋白高表达的Hep G2细胞有很强的亲和力并在高表达的GRP78的Hep G2肿瘤中显示出高特异性积累。[68Ga]SP94在各组中的肿瘤组织的摄取量与各组在体外实验中检测出的GRP78的表达水平呈一致趋势,其在各组中的摄取量与各组治疗疗效的实验结果比较分析的结果表明[68Ga]SP94在一定程度上可被用来评估Hep G2荷瘤小鼠体内内质网应激水平的变化以及内质网应激对肝癌细胞抗肿瘤药物敏感性的影响。从而可以为未来抗凋亡肝细胞癌的诊断和疗效评估方面带来新的思路。