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目的
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，并且其人数在不断增加，5年生存率不超过15%。由于肺癌的发病机制仍不清楚，因此急需探索肺癌发生和发展的分子机制，寻找特异性高的诊断及治疗靶标。
越来越多的研究证实lncRNA在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多种层面上调控基因的表达转录或翻译水平，进而对细胞的生长、发育、分化、增殖、细胞周期和凋亡等细胞生物学行为都起着十分重要的作用。lncRNA失调是多种癌症包括肺癌的特征之一，它可以通过多种机制促进肿瘤的发生发展及侵袭转移。
Longnon-codingRNA（lncRNA）RPLP0P2作为一个新的lncRNA，在肺腺癌（Lungadenocarcinoma，LAD）中的作用机制尚不清楚。我们前期已通过基因芯片技术获得了肺腺癌差异性lncRNA表达谱，其中RPLP0P2为明显表达下调的lncRNA之一，并通过生物信息分析认为LRRC10B为RPLP0P2调控的一个靶基因。本次实验旨在分析RPLP0P2在肺腺癌中的表达，并初步探讨其在肺腺癌中的作用机制，以期为肺腺癌的诊断和治疗提供新的靶点。
方法
1.肺癌组织样本收集收集温州医科大学附属第一医院2013年8月—2014年8月间57例LAD患者癌组织及配对的癌旁组织，并收集所有病人的相关临床和病理资料，以上LAD患者均经组织学确诊。所有组织标本切除后立即速冻于液氮中。通过电话或其他方式随访了35名LAD患者，最长随访时间为28个月。
2.总RNA提取和qRT-PCR分析应用Trizol法提取组织细胞总RNA，并采用qRT-PCR检测组织标本中的lncRNARPLP0P2表达水平和LRRC10BmRNA表达水平。
3.细胞培养体外培养正常人类支气管上皮细胞株BEAS-2B和5种人类相关LAD细胞株（SPCA-1、NCI-H1299、A549、NCI-H441、LTEP-a2）。
4.siRNA载体构建及转染按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明构建慢病毒介导的RPLP0P2siRNA，并转染LETP-a2细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测转染后LETP-a2细胞lncRNARPLP0P2、LRRC10BmRNA的变化。
5.过表达载体构建及转染按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明构建慢病毒介导的RPLP0P2过表达载体，并转染A549细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测转染后A549细胞lncRNARPLP0P2、LRRC10BmRNA的变化。
6.细胞增殖能力检测接种细胞于96孔板，37℃，5%CO2培养。分别于感染第ld、3d、5d和7d，向每孔加入10μLCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7.细胞迁移能力检测用胰酶消化细胞并制成单细胞悬液，加入到侵袭小室内，培养24h后，弃去小室内培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定20min（或用95%酒精固定10min），0.1%结晶紫染色15-20min，清水洗3遍以上，200×显微镜下计数10个视野，并拍照。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液在酶标仪上570nm测其吸光度值。
8.细胞侵袭能力检测同迁移能力检测。Transwell法检测细胞侵袭能力，需要铺Matrigel胶。
9.细胞粘附能力检测每个实验组都包括2种处理组：未包被处理（CON组），纤维链接蛋白包被处理（FN组）。消化已转染的细胞，加入96孔板中，培养30min。经BSA洗脱，多聚甲醛固定细胞，结晶紫对黏附细胞进行染色，去离子水冲洗后加入2%SDS溶液，25℃反应30min以溶解结晶紫，读取OD550nm值，统计比较各组结果差异。
10.细胞周期检测将细胞用70%冰乙醇固定，4℃放置过夜。上机前用PBS重悬细胞，37℃温育30min，然后加入0.1mg/mL碘化丙啶进行细胞染色10min。用流式细胞仪测试细胞DNA含量。
11.细胞凋亡检测将细胞用PBS洗涤离心收集沉淀，加入冰冷LysisBuffer，冻融2-3遍，震荡后离心吸取上清，加入2×ReactionBuffer；加入Caspase3及Caspase9Substrate并于37℃避光孵育4h；测定405nm吸光值，分析Caspase3及Caspase9活化程度。
12.统计学分析数据统计分析采用SPSS20.0软件。多组间数据比较，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料采用Kruskal-WallisH检验。两两数据比较，正态分布资料采用LSD检验或t检验，非正态分布资料采用Mann-WhitneyU检验。生存分析采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.RPLP0P2在肺腺癌组织中的表达水平及与临床资料的关系RPLP0P2在肺腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织（P＜0.05）。RPLP0P2在肺腺癌淋巴结转移组中的表达水平明显低于淋巴结未转移组（P＜0.05）。RPLP0P2表达水平与肺腺癌的临床分期、分化程度、是否吸烟、性别均无显著相关（P＞0.05）。LRRC10BmRNA在肺腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。Pearson相关分析显示RPLP0P2表达水平与LRRC10BmRNA表达水平成负相关（Pearsoncorrelation=-0.754,P=0.0021）。
2.RPLP0P2表达水平与肺腺癌预后的关系在LAD患者中，RPLP0P2低表达组的总体生存时间明显低于RPLP0P2高表达组（P＜0.05）。
3.RPLP0P2在五种人类LAD细胞株中的表达水平LETP-a2细胞株的RPLP0P2表达水平最高，SPCA-1和NCI-H441细胞株呈中度表达水平，而A549和NCI-H1299细胞表达水平最低。
4.RPLP0P2和LRRC10B在三组不同处理A549及LETP-a2细胞中的表达水平比较过表达RPLP0P2的A549细胞组的RPLP0P2表达水平明显高于NC组和control组（P＜0.05），RPLP0P2过表达组LRRC10BmRNA表达水平明显低于NC组和control组（P＜0.05）。RPLP0P2siRNA的LETP-a2细胞组的RPLP0P2表达水平明显低于NC组和control组（P＜0.05），RPLP0P2siRNA组的LRRC10BmRNA表达水平明显高于NC组和control组（P＜0.05）。但是在LRRC10BsiRNA三组不同处理LETP-a2细胞后RPLP0P2表达水平无明显变化（P＞0.05）。
5.RPLP0P2对细胞增殖的影响与对照组及NC组相比，RPLP0P2过表达组OD450在转染后第5d和第7d显著减少，干扰组OD450在转染后第5d和第7d显著增加（P＜0.05）。
6.RPLP0P2对细胞迁移的影响三组不同处理A549及LETP-a2细胞之间的OD570值均无显著性差异（P＞0.05）。
7.RPLP0P2对细胞侵袭的影响三组不同处理A549及LETP-a2细胞之间的OD570值也无显著性差异（P＞0.05）。
8.RPLP0P2对细胞粘附的影响在CON组中的control及NC组的OD550明显高于RPLP0P2过表达组（P＜0.05），与CON组相比较，FN处理过的control及NC组OD550明显增高，而FN处理过RPLP0P2过表达组明显低于control及NC组（P＜0.05）；在CON组中的control及NC组的OD550明显低于RPLP0P2干扰组（P＜0.05），与CON组相比较，FN处理过的control及NC组OD550明显明显增高，而FN处理过RPLP0P2干扰组明显高于control及NC组（P＜0.05）。
9.RPLP0P2对细胞周期的影响RPLP0P2过表达后，S期和G2/M期的A549细胞显著减少，而G0/G1期细胞的A549细胞明显增加；RPLP0P2siRNA后，S期和G2/M期细胞的LETP-a2的显著增加，而G0/G1期细胞明显降低。
10.RPLP0P2对细胞凋亡的影响与control、NC组比较，RPLP0P2过表达后的Caspase3及Caspase9吸光度明显增加，说明活性明显增强，即细胞凋亡明显增加；而与control、NC组比较，RPLP0P2干扰组，Caspase3及Caspase9吸光度明显降低。
结论
1.RPLP0P2在肺腺癌组织中低表达。淋巴结转移患者中的RPLP0P2表达水平明显低于淋巴结未转移患者；RPLP0P2表达水平与肺腺癌的临床分期、分化程度、是否吸烟、性别均无明显相关。
2.RPLP0P2表达水平与肺腺癌患者生存时间成正相关。
3.RPLP0P2具有增加肺腺癌细胞凋亡，降低细胞增殖、黏附的作用，故其为抑癌性lncRNA分子。
4.LRRC10B可能为RPLP0P2下游的靶基因。
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，并且其人数在不断增加，5年生存率不超过15%。由于肺癌的发病机制仍不清楚，因此急需探索肺癌发生和发展的分子机制，寻找特异性高的诊断及治疗靶标。
越来越多的研究证实lncRNA在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多种层面上调控基因的表达转录或翻译水平，进而对细胞的生长、发育、分化、增殖、细胞周期和凋亡等细胞生物学行为都起着十分重要的作用。lncRNA失调是多种癌症包括肺癌的特征之一，它可以通过多种机制促进肿瘤的发生发展及侵袭转移。
Longnon-codingRNA（lncRNA）RPLP0P2作为一个新的lncRNA，在肺腺癌（Lungadenocarcinoma，LAD）中的作用机制尚不清楚。我们前期已通过基因芯片技术获得了肺腺癌差异性lncRNA表达谱，其中RPLP0P2为明显表达下调的lncRNA之一，并通过生物信息分析认为LRRC10B为RPLP0P2调控的一个靶基因。本次实验旨在分析RPLP0P2在肺腺癌中的表达，并初步探讨其在肺腺癌中的作用机制，以期为肺腺癌的诊断和治疗提供新的靶点。
方法
1.肺癌组织样本收集收集温州医科大学附属第一医院2013年8月—2014年8月间57例LAD患者癌组织及配对的癌旁组织，并收集所有病人的相关临床和病理资料，以上LAD患者均经组织学确诊。所有组织标本切除后立即速冻于液氮中。通过电话或其他方式随访了35名LAD患者，最长随访时间为28个月。
2.总RNA提取和qRT-PCR分析应用Trizol法提取组织细胞总RNA，并采用qRT-PCR检测组织标本中的lncRNARPLP0P2表达水平和LRRC10BmRNA表达水平。
3.细胞培养体外培养正常人类支气管上皮细胞株BEAS-2B和5种人类相关LAD细胞株（SPCA-1、NCI-H1299、A549、NCI-H441、LTEP-a2）。
4.siRNA载体构建及转染按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明构建慢病毒介导的RPLP0P2siRNA，并转染LETP-a2细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测转染后LETP-a2细胞lncRNARPLP0P2、LRRC10BmRNA的变化。
5.过表达载体构建及转染按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明构建慢病毒介导的RPLP0P2过表达载体，并转染A549细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测转染后A549细胞lncRNARPLP0P2、LRRC10BmRNA的变化。
6.细胞增殖能力检测接种细胞于96孔板，37℃，5%CO2培养。分别于感染第ld、3d、5d和7d，向每孔加入10μLCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7.细胞迁移能力检测用胰酶消化细胞并制成单细胞悬液，加入到侵袭小室内，培养24h后，弃去小室内培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定20min（或用95%酒精固定10min），0.1%结晶紫染色15-20min，清水洗3遍以上，200×显微镜下计数10个视野，并拍照。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液在酶标仪上570nm测其吸光度值。
8.细胞侵袭能力检测同迁移能力检测。Transwell法检测细胞侵袭能力，需要铺Matrigel胶。
9.细胞粘附能力检测每个实验组都包括2种处理组：未包被处理（CON组），纤维链接蛋白包被处理（FN组）。消化已转染的细胞，加入96孔板中，培养30min。经BSA洗脱，多聚甲醛固定细胞，结晶紫对黏附细胞进行染色，去离子水冲洗后加入2%SDS溶液，25℃反应30min以溶解结晶紫，读取OD550nm值，统计比较各组结果差异。
10.细胞周期检测将细胞用70%冰乙醇固定，4℃放置过夜。上机前用PBS重悬细胞，37℃温育30min，然后加入0.1mg/mL碘化丙啶进行细胞染色10min。用流式细胞仪测试细胞DNA含量。
11.细胞凋亡检测将细胞用PBS洗涤离心收集沉淀，加入冰冷LysisBuffer，冻融2-3遍，震荡后离心吸取上清，加入2×ReactionBuffer；加入Caspase3及Caspase9Substrate并于37℃避光孵育4h；测定405nm吸光值，分析Caspase3及Caspase9活化程度。
12.统计学分析数据统计分析采用SPSS20.0软件。多组间数据比较，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料采用Kruskal-WallisH检验。两两数据比较，正态分布资料采用LSD检验或t检验，非正态分布资料采用Mann-WhitneyU检验。生存分析采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.RPLP0P2在肺腺癌组织中的表达水平及与临床资料的关系RPLP0P2在肺腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织（P＜0.05）。RPLP0P2在肺腺癌淋巴结转移组中的表达水平明显低于淋巴结未转移组（P＜0.05）。RPLP0P2表达水平与肺腺癌的临床分期、分化程度、是否吸烟、性别均无显著相关（P＞0.05）。LRRC10BmRNA在肺腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。Pearson相关分析显示RPLP0P2表达水平与LRRC10BmRNA表达水平成负相关（Pearsoncorrelation=-0.754,P=0.0021）。
2.RPLP0P2表达水平与肺腺癌预后的关系在LAD患者中，RPLP0P2低表达组的总体生存时间明显低于RPLP0P2高表达组（P＜0.05）。
3.RPLP0P2在五种人类LAD细胞株中的表达水平LETP-a2细胞株的RPLP0P2表达水平最高，SPCA-1和NCI-H441细胞株呈中度表达水平，而A549和NCI-H1299细胞表达水平最低。
4.RPLP0P2和LRRC10B在三组不同处理A549及LETP-a2细胞中的表达水平比较过表达RPLP0P2的A549细胞组的RPLP0P2表达水平明显高于NC组和control组（P＜0.05），RPLP0P2过表达组LRRC10BmRNA表达水平明显低于NC组和control组（P＜0.05）。RPLP0P2siRNA的LETP-a2细胞组的RPLP0P2表达水平明显低于NC组和control组（P＜0.05），RPLP0P2siRNA组的LRRC10BmRNA表达水平明显高于NC组和control组（P＜0.05）。但是在LRRC10BsiRNA三组不同处理LETP-a2细胞后RPLP0P2表达水平无明显变化（P＞0.05）。
5.RPLP0P2对细胞增殖的影响与对照组及NC组相比，RPLP0P2过表达组OD450在转染后第5d和第7d显著减少，干扰组OD450在转染后第5d和第7d显著增加（P＜0.05）。
6.RPLP0P2对细胞迁移的影响三组不同处理A549及LETP-a2细胞之间的OD570值均无显著性差异（P＞0.05）。
7.RPLP0P2对细胞侵袭的影响三组不同处理A549及LETP-a2细胞之间的OD570值也无显著性差异（P＞0.05）。
8.RPLP0P2对细胞粘附的影响在CON组中的control及NC组的OD550明显高于RPLP0P2过表达组（P＜0.05），与CON组相比较，FN处理过的control及NC组OD550明显增高，而FN处理过RPLP0P2过表达组明显低于control及NC组（P＜0.05）；在CON组中的control及NC组的OD550明显低于RPLP0P2干扰组（P＜0.05），与CON组相比较，FN处理过的control及NC组OD550明显明显增高，而FN处理过RPLP0P2干扰组明显高于control及NC组（P＜0.05）。
9.RPLP0P2对细胞周期的影响RPLP0P2过表达后，S期和G2/M期的A549细胞显著减少，而G0/G1期细胞的A549细胞明显增加；RPLP0P2siRNA后，S期和G2/M期细胞的LETP-a2的显著增加，而G0/G1期细胞明显降低。
10.RPLP0P2对细胞凋亡的影响与control、NC组比较，RPLP0P2过表达后的Caspase3及Caspase9吸光度明显增加，说明活性明显增强，即细胞凋亡明显增加；而与control、NC组比较，RPLP0P2干扰组，Caspase3及Caspase9吸光度明显降低。
结论
1.RPLP0P2在肺腺癌组织中低表达。淋巴结转移患者中的RPLP0P2表达水平明显低于淋巴结未转移患者；RPLP0P2表达水平与肺腺癌的临床分期、分化程度、是否吸烟、性别均无明显相关。
2.RPLP0P2表达水平与肺腺癌患者生存时间成正相关。
3.RPLP0P2具有增加肺腺癌细胞凋亡，降低细胞增殖、黏附的作用，故其为抑癌性lncRNA分子。
4.LRRC10B可能为RPLP0P2下游的靶基因。