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背景和目的
现如今核酸的检测技术越来越多样化，例如核酸杂交技术，DNA测序技术，聚合酶链式反应(PCR)，基因芯片等。这些核酸检测技术大大提高核酸检测的灵敏度，实现核酸的定量检测。现已被广泛应用于核酸检测工作中。然而这些技术存在操作繁琐，必须依赖精密的仪器的弊端，因此只能在有特殊管理的分子实验室使用。为了简化核酸分子的检测过程，近年来新发展的核酸等温扩增技术越来越受到研究者的关注。与其他核酸检测技术相比，核酸的等温扩增技术不需要复杂的热循环仪，只需要提供稳定温度，且检测速度快，特异性高。不仅降低了投资成本，同时这类核酸检测技术也有利于核酸分子的即时检验技术(POCT)的发展。
近年来人们对高灵敏度、高选择性的DNA探针的需求不断增加，并通过各种分子工程策略开发出了多种DNA探针。分子信标(MB)探针是一种荧光标记的长度在25～35个核苷酸之间寡核苷酸，其结构可分为茎、环和报告基团三部分。与其它核酸探针相比，MB具有更高的灵敏度、更快的响应速度和更广泛的通用性，使其成为化学传感、环境监测和生物成像的理想探针。目前很多的研究者也开发出多种基于分子信标结构的核酸检测探针用于等温扩增检测技术中。但是这些方法一般都是在分子信标的结构上进行修改。例如在分子信标的环区结构上添加新的功能结构域或者在茎区结构上修饰特殊的化学键来构建更加高级的分子信标；但是，在分子信标茎环结构上的修改有可能增加MB的构像变异，产生多种二级结构，影响分子信标探针的特异性，同时也会增加序列设计与探针合成的难度。
在本研究中，我们构建了基于toehold链置换的分子信标(Toeholdmediatedstranddisplacementreaction，ToMB)模型的核酸检测新方法，即在普通分子信标的5’端添加toehold结构域，在3’端添加链置换结构域。该设计并未修改分子信标本身的结构，而是将分子信标设计成链置换反应的开关，当分子信标与靶标结合，分子信标的发夹结构打开，同时两端连接的toehold结构域与链置换结构域分开，链置换反应受阻。其中链置换反应速率与靶序列诱导的MB构象的改变相关，从而实现靶序列的定量检测。我们进一步将ToMB模型偶联额外的核酸检测放大系统，即杂交链式反应系统(hybridizationchainreactionsystem)，来提高检测的灵敏度；还设计了一个基本的OR逻辑门，以验证ToMB模型的通用性。
方法：
我们选择PCA3基因作为靶序列，其余探针的序列均使用NUPACK软件设计。使用STEPONEPlusPCR仪器实时检测链置换反应荧光强度的变化，并结合琼脂糖凝胶电泳一起分析核酸杂交反应后的结果。
结果：
1．通过一系列的设计和实验，结果发现，ToMB模型与传统的分子信标相比，ToMB模型不但高度保留了传统分子信标的检测特异性，而且该模型线性范围达到31.25nM到625nM，比传统分子信标的线性范围（31.25nM到375nM）更宽。
2．同时，该模型也能很好的区别靶核酸的不同突变个数。与完整靶物质相比，具有一个，两个，三个碱基突变的目标分子的信号分别降低11%，24%和38%。
3．我们将ToMB模型偶联杂交链式反应系统(hybridizationchainreactionsystem)来实现检测信号的方法，结果发现，ToMB-HCR核酸检测系统的检测限低至15.6nM。与无扩增的ToMB系统相比，该系统使核酸的检测灵敏度有所提高。
4．将ToMB核酸检测系统应用在OR逻辑电路上，结果发现，反应体系中有任何一种靶分子存在，输出端的荧光信号强度均发生明显变化。
结论：
我们的结果表明，ToMB模型不仅是一个很好的核酸检测的纳米模型，还可作为一种多功能的生物传感器。
现如今核酸的检测技术越来越多样化，例如核酸杂交技术，DNA测序技术，聚合酶链式反应(PCR)，基因芯片等。这些核酸检测技术大大提高核酸检测的灵敏度，实现核酸的定量检测。现已被广泛应用于核酸检测工作中。然而这些技术存在操作繁琐，必须依赖精密的仪器的弊端，因此只能在有特殊管理的分子实验室使用。为了简化核酸分子的检测过程，近年来新发展的核酸等温扩增技术越来越受到研究者的关注。与其他核酸检测技术相比，核酸的等温扩增技术不需要复杂的热循环仪，只需要提供稳定温度，且检测速度快，特异性高。不仅降低了投资成本，同时这类核酸检测技术也有利于核酸分子的即时检验技术(POCT)的发展。
近年来人们对高灵敏度、高选择性的DNA探针的需求不断增加，并通过各种分子工程策略开发出了多种DNA探针。分子信标(MB)探针是一种荧光标记的长度在25～35个核苷酸之间寡核苷酸，其结构可分为茎、环和报告基团三部分。与其它核酸探针相比，MB具有更高的灵敏度、更快的响应速度和更广泛的通用性，使其成为化学传感、环境监测和生物成像的理想探针。目前很多的研究者也开发出多种基于分子信标结构的核酸检测探针用于等温扩增检测技术中。但是这些方法一般都是在分子信标的结构上进行修改。例如在分子信标的环区结构上添加新的功能结构域或者在茎区结构上修饰特殊的化学键来构建更加高级的分子信标；但是，在分子信标茎环结构上的修改有可能增加MB的构像变异，产生多种二级结构，影响分子信标探针的特异性，同时也会增加序列设计与探针合成的难度。
在本研究中，我们构建了基于toehold链置换的分子信标(Toeholdmediatedstranddisplacementreaction，ToMB)模型的核酸检测新方法，即在普通分子信标的5’端添加toehold结构域，在3’端添加链置换结构域。该设计并未修改分子信标本身的结构，而是将分子信标设计成链置换反应的开关，当分子信标与靶标结合，分子信标的发夹结构打开，同时两端连接的toehold结构域与链置换结构域分开，链置换反应受阻。其中链置换反应速率与靶序列诱导的MB构象的改变相关，从而实现靶序列的定量检测。我们进一步将ToMB模型偶联额外的核酸检测放大系统，即杂交链式反应系统(hybridizationchainreactionsystem)，来提高检测的灵敏度；还设计了一个基本的OR逻辑门，以验证ToMB模型的通用性。
方法：
我们选择PCA3基因作为靶序列，其余探针的序列均使用NUPACK软件设计。使用STEPONEPlusPCR仪器实时检测链置换反应荧光强度的变化，并结合琼脂糖凝胶电泳一起分析核酸杂交反应后的结果。
结果：
1．通过一系列的设计和实验，结果发现，ToMB模型与传统的分子信标相比，ToMB模型不但高度保留了传统分子信标的检测特异性，而且该模型线性范围达到31.25nM到625nM，比传统分子信标的线性范围（31.25nM到375nM）更宽。
2．同时，该模型也能很好的区别靶核酸的不同突变个数。与完整靶物质相比，具有一个，两个，三个碱基突变的目标分子的信号分别降低11%，24%和38%。
3．我们将ToMB模型偶联杂交链式反应系统(hybridizationchainreactionsystem)来实现检测信号的方法，结果发现，ToMB-HCR核酸检测系统的检测限低至15.6nM。与无扩增的ToMB系统相比，该系统使核酸的检测灵敏度有所提高。
4．将ToMB核酸检测系统应用在OR逻辑电路上，结果发现，反应体系中有任何一种靶分子存在，输出端的荧光信号强度均发生明显变化。
结论：
我们的结果表明，ToMB模型不仅是一个很好的核酸检测的纳米模型，还可作为一种多功能的生物传感器。