突变型p53通过Rac1-AKT信号通路促进人非小细胞肺癌增殖

• 作 者: 吴芳南
• 机 构: 温州医科大学
• 出 处: 温州医科大学
• 发表日期: 2019年1期
• 关键词: 非小细胞肺癌

背景：
　　肺癌是世界范围内癌症死亡最主要的原因，根据肺癌的病理组织学表现主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中非小细胞肺癌最为常见，约占所有肺癌的80%；小细胞肺癌约占所有肺癌的20%。由于肺癌的发病率和死亡率最高，是人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，目前仍无有效的治疗措施，故对其机制研究具有十分重要的意义。在人非小细胞肺癌中，TP53是发生突变频率最高的基因。p53是重要的肿瘤抑制因子，在维持基因组稳定性和肿瘤抑制方面发挥重要的功能作用。野生型p53能抑制肿瘤的发展，而突变型p53不仅会丢失其野生型肿瘤抑制的功能，同时也会获得新的独立于野生型p53的致癌性功能作用。然而，关于突变型p53获得性功能的研究并不十分清楚。最近，我们发现了突变型p53在人非小细胞肺癌中新的获得性功能。
　　目的：
　　对人非小细胞肺癌中突变型p53获得性功能进行相关机制探究，为今后临床肿瘤治疗尤其是人非小细胞肺癌患者的靶向治疗提供相关理论依据。
　　方法：
　　1.对比对照组H1299细胞，过表达突变型p53（R175H）蛋白在H1299细胞内，通过Westernblot检测AKT的磷酸化水平。
　　2.表达Rac1或突变型p53蛋白或同时表达两者，通过Westernblot检测不同的表达对H1299细胞内PAK1和AKT磷酸化水平的影响。用Rac1抑制剂NSC23766处理细胞，观察在阻断Rac1活性后突变型p53对H1299细胞中PAK1和AKT磷酸化的影响。
　　3.通过细胞生长曲线和软琼脂实验探究突变型p53是否可以通过Rac1-AKT信号通路促进H1299细胞的增殖。
　　4.內源性敲减Rac1的H1299mutp53（R175H）细胞中，分别转染野生型Rac1和去SUMOylation修饰的Rac1质粒，通过Westernblot检测细胞内PAK1和AKT的磷酸化水平。通过细胞生长曲线实验观察Rac1SUMOylation修饰是否在突变型p53激活AKT信号中促进H1299细胞增殖也是发挥至关重要作用。
　　5.在H1299细胞内，通过蛋白质免疫共沉淀实验验证AKT和DAB2IP可以结合。通过蛋白质免疫共沉淀实验验证突变型p53对AKT和DAB2IP结合的影响，观察Rac1单独作用及与突变型p53联合作用对AKT和DAB2IP结合的影响，并对蛋白质免疫共沉淀中的蛋白条带进行定量分析。
　　结果：
　　1.我们发现在无p53基因的人非小细胞肺癌细胞系H1299细胞中，过表达突变型p53R175H可以增加AKT的磷酸化水平。
　　2.我们发现在H1299细胞系中过表达Rac1可以增加AKT的磷酸化水平。对比单独表达Rac1或突变型p53R175H质粒，在H1299细胞系中同时表达突变型p53R175H和Rac1能明显增强AKT的磷酸化作用。用NSC23766阻断Rac1的活性,我们发现抑制Rac1的活性可以明显阻断突变型p53诱导的AKT磷酸化。
　　3.在H1299细胞中，內源性敲减Rac1可以抑制突变型p53诱导的细胞增殖，而用AKT信号抑制剂Wortmannin处理细胞，发现抑制AKT的活性不能进一步加强Rac1敲减所致的抑制效应。
　　4.在內源性敲减Rac1的H1299mutp53R175H细胞中，重新表达野生型Rac1可以恢复由突变型p53诱导AKT的磷酸化和肿瘤细胞的增殖，而重新表达去SUMOylation修饰的Rac1则无此效应。
　　5.在H1299表达Rac1,DAB2IP和AKT，发现Rac1可以直接抑制DAB2IP与AKT的结合。我们分析了存在和不存在突变型p53表达的条件下，观察Rac1对DAB2IP与AKT的作用，并对蛋白质免疫共沉淀的结果行定量分析。结果发现：对比无突变型p53表达的H1299细胞,过表达突变型p53能明显提高Rac1对DAB2IP与AKT抑制作用。
　　结论：
　　我们研究结果揭示了突变型p53新的获得性功能机制：突变型p53可以通过Rac1激活AKT信号通路，促进人非小细胞肺癌增殖。在该通路中Rac1SUMOylation修饰发挥着非常关键的作用。此外，我们发现Rac1可以直接抑制肿瘤抑制因子DAB2IP与AKT的结合，并且突变型p53可以加强Rac1的抑制效应。这些发现可能为以后人非小细胞肺癌患者提供新的靶向治疗方向。