靶向人胶质瘤细胞的核酸适配体用于体内成像及其靶标鉴定的研究

• 作 者: 林宁钦
• 出 处: 福建医科大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 脑胶质瘤 核酸适配体 活体分子探针成像 靶标鉴定 纤维粘连蛋白

目的:脑胶质瘤的影像学诊断主要依靠计算机断层扫描和核磁共振成像,而一些非肿瘤性疾病容易与其混淆,造成误诊。分子影像学技术可以通过靶向识别分子探针,实现细胞或分子水平的生物学成像,为解决影像学的误诊问题提供了有力的工具。作为一种新型靶向识别分子,核酸适配体具有亲和力强、生物相容性好等优点,广泛应用于肿瘤细胞的体内外成像。本研究旨在通过化学修饰来改进靶向脑胶质瘤细胞的核酸适配体,评估修饰后核酸适配体的靶向识别能力和体内稳定性;并通过荷瘤小鼠模型测试,明确核酸适配体用于脑胶质瘤活体成像的可行性;最后通过联用质谱分析等技术,鉴定核酸适配体的靶标分子。本研究将以靶向脑胶质瘤细胞的核酸适配体为基点,为基于核酸适配体的脑胶质瘤活体分子成像奠定基础,并有望进一步为脑胶质瘤的诊断提供新的候选靶点。方法:1、对核酸适配体进行化学修饰,采用流式细胞术检测修饰后核酸适配体与胶质瘤细胞的结合效果,采用琼脂糖凝胶电泳检测修饰后核酸适配体在血清中的稳定性,评估核酸适配体分子探针的靶向识别能力和体内稳定性;2、通过异种移植方式构建脑胶质瘤荷瘤小鼠模型,以荧光修饰的核酸适配体作为分子探针,采用小动物活体成像技术对核酸适配体分子探针和随机序列的体内分布情况进行监测,探究核酸适配体分子探针用于脑胶质瘤活体成像的可行性;3、采用核酸适配体分离富集、质谱分析等手段鉴定核酸适配体的靶标分子,并采用蛋白质印迹法(Western blot)、表面等离子共振技术(SPR)、小干扰RNA转染等方法验证核酸适配体的靶标;4、采用免疫组织化学染色法,检测10例正常脑组织,44例星形细胞瘤(WHO II-III),22例胶质母细胞瘤(WHO IV)中靶标分子的表达情况。结果:1、化学修饰后核酸适配体分子依然具有靶向识别胶质瘤细胞的能力,且修饰后,核酸适配体在血清中的稳定存在时间可以长达24小时,比未进行化学修饰的核酸适配体提高了12小时,说明化学修饰后的核酸适配体分子探针保留了靶向识别能力,并具有良好的血清稳定性;2、荷瘤小鼠活体荧光成像结果显示核酸适配体可以特异性的富集在小鼠的肿瘤部位,注射1小时后肿瘤部位荧光信号达到最强,注射4小时后肿瘤部位仍可以观察到明显信号,初步实现基于核酸适配体分子探针的脑胶质瘤小鼠活体成像,表明核酸适配体分子探针具有用于脑胶质瘤活体成像的可行性;3、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示在260 kDa附近,核酸适配体组的泳道有一明显差异条带,质谱结果显示核酸适配体的靶标分子可能是纤维粘连蛋白,Western blot结果显示只有在核酸适配体组检测到纤维粘连蛋白的存在,SPR结果显示核酸适配体与纤维粘连蛋白的平衡解离常数是125nM,小干扰RNA转染结果显示敲低纤维粘连蛋白后的胶质瘤细胞与核酸适配体的结合效果减弱,多方面验证结果均显示核酸适配体的靶标分子为纤维粘连蛋白;4、免疫组织化学染色结果显示纤维粘连蛋白在正常脑组织、星形细胞瘤(WHO II-III)和胶质母细胞瘤(WHO IV)的组织化学评分的均值分别为5.62,56.99,95.93,该蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的升高而增加。结论:1、化学修饰后的核酸适配体分子探针具有良好的血清稳定性,并保留原有的靶向识别能力;2、初步实现基于核酸适配体分子探针的脑胶质瘤小鼠活体成像,表明核酸适配体分子探针具有用于脑胶质瘤活体成像的潜力;3、核酸适配体结合胶质瘤细胞的靶标分子是纤维粘连蛋白,该蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的升高而增加。