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目的：镉及其化合物是一类工业毒物和环境污染物,而且是一种生物半减期很长(19-30年)的多器官、多系统毒物,是对人类危害最大的金属毒物之一,国际癌症研究机构(IARC)早在1993年就将其归类为第一类致癌物,然而其分子传致癌机制至今仍未阐明。
肿瘤的发生发展是内外环境因素导致的涉及多阶段和多种基因改变的复杂过程,这些基因的改变往往与机体内的遗传因素和环境致癌因素的长期累积性损伤作用有关。目前大多数的研究表明,镉的遗传毒作用不明显,其直接导致DNA突变或形成DNA加合物的能力微弱,作为肿瘤启发剂的作用有限,这似乎提示,表遗传可能在镉致癌中发挥重要作用。为了进一步明确镉的致癌机制,本研究选择不同剂量组氯化镉诱发永生化人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化不同阶段及接种裸鼠成瘤的细胞为研究对象,选择部分肿瘤相关基因进行甲基化状态和蛋白表达情况的检测,从表遗传方面探讨镉的致癌机制,并为寻找肿瘤的早期生物检测指标提供新的依据。同时,对转化期间和成瘤细胞采用去甲基化因子5-脱氧杂氮胞苷(5-Azac)进行处理,检测该模型中不同阶段细胞的相关基因启动子区CpG岛的甲基化逆转情况,从而为肿瘤的基因治疗提供进一步的理论依据。
方法：
1、细胞培养及去甲基化处理将非转化16HBE对照细胞、5μmol/L(低)、10μmol/L(中)、15μmol/L(高)三个剂量组氯化镉恶性转化16HBE细胞第15代(转化初期)、第25代(转化中期)及第35代接种裸鼠成瘤细胞、大细胞肺癌细胞株NCIH460进行复苏和培养,并用去甲基化因子5-Azac处理各组细胞。
2、各组细胞基因组DNA的提取对用5-Azac处理及未处理的非转化16HBE细胞、高、中、低剂量组氯化镉恶性转化初期、中期及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞,以及大细胞肺癌细胞株NCIH460进行基因组DNA的抽提,并用核酸蛋白定量仪及琼脂糖凝胶电泳方法检测其纯度及完整性。
3、基因甲基化及非甲基化引物的设计从Genbank中调出人的p16、c-jun、hMSH2基因的资料,查找出其肩动子所在区域的序列,据此用Primer express 2.0软件设计甲基化及非甲基化引物,并在ABI3900台式高通量DNA合成仪上合成该引物。
4、MSP法检测相关基因启动子区CpG岛的甲基化情况对前述提取的各细胞株DNA经亚硫酸氢盐修饰后,用设计合成的相关基因甲基化及非甲基化引物对所选的基因进行特异性扩增,分别取各阶段细胞及NCIH460大细胞肺癌细胞株的5μl甲基化与未甲基化的扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
5、相关基因启动子区CpG岛的甲基化逆转情况的检测高、中、低剂量组氯化镉恶性转化不同阶段及接种裸鼠成瘤的16HBE以及大细胞肺癌细胞株NCIH460分别用去甲基化因子5-Azac处理后,再次用MSP法检测相关基因肩动子区CpG岛的甲基化逆转情况。
6、hMSH2基因蛋白表达水平检测对非转化16HBE细胞、高、中、低剂量组氯化镉恶性转化初期、中期及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞,以及大细胞肺癌细胞株NCIH460进行免疫组织化学(SP法)实验,检测hMSH2基因蛋白表达的动态变化情况。
结果：
1、各细胞基因组DNA的纯度及完整性鉴定经核酸蛋白定量仪测得各细胞株基因组DNA的OD260nm/OD280m比值为1.75～1.90。各细胞株DNA经2％琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶紫外分析仪下可见基因组DNA呈单一条带,且大于分子量标准10kb,表明抽提的DNA纯度良好,无蛋白质和其它小分子污染；抽提的基因组DNA完整无降解,可用于下游实验。
2、不同剂量镉转化16HBE细胞中相关基因启动子区CpG岛甲基化情况以非转化16HBE细胞为阴性对照细胞,以大细胞肺癌细胞株NCIH460为阳性对照细胞,将各剂量组氯化镉恶性转化细胞及成瘤细胞分别与阴性对照16HBE细胞及阳性对照NCIH460细胞进行比较。结果显示,各组细胞的p16基因和hMSH2基因均出现异常高甲基化现象,而且在转化初期、中期,随着染毒剂量的增加,同期转化细胞中基因的甲基化程度也有明显升高的趋势,但在接种裸鼠成瘤细胞中,各剂量组之间p16和hMSH2基因的甲基化程度无明显差异。而原癌基因c-jun启动子区CpG岛却出现甲基化程度减弱的现象,同期转化细胞中各剂量组之间的甲基化变化情况无明显差异。
3、镉转化不同阶段16HBE细胞中相关基因启动子区CpG岛甲基化情况以非转化16HBE细胞为阴性对照细胞,以大细胞肺癌细胞株NCIH460为阳性对照细胞,将各不同阶段的转化细胞及成瘤细胞分别与非转化16HBE对照细胞及大细胞肺癌细胞株NCIH460进行比较。结果表明,氯化镉恶性转化不同阶段的16HBE细胞中抑癌基因p16及DNA错配修复基因hMSH2启动子区CpG岛部位均有不同程度的甲基化增高的现象,且随着细胞恶性转化程度的增加,甲基化现象有明显升高的趋势。而氯化镉恶性转化不同阶段的16HBE细胞中原癌基因c-jun启动子区CpG岛部位虽然均有不同程度的甲基化减弱的现象,但以成瘤细胞内c-jun启动子区CpG岛甲基化减弱的程度最为明显。
4、相关基因启动子区CpG岛甲基化的逆转情况用去甲基化因子5-Azac处理原来启动子区存在高甲基化的各剂量组氯化镉恶性转化不同阶段及其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞以及大细胞肺癌细胞株NCIH460细胞后,再次用MSP方法检测上述各细胞中p16、hMSH2基因启动子区CpG岛的甲基化状态,结果显示用p16、hMSH2未甲基化引物扩增经亚硫酸氢盐化学修饰的模板,检测细胞均出现了未甲基化的目的条带；用甲基化引物扩增经化学修饰的模板,原来启动子区存在异常高甲基化的各剂量组氯化镉恶性转化不同阶段的16HBE细胞的p16基因和hMSH2基因均为阴性,但接种裸鼠成瘤以及大细胞肺癌细胞株NCIH460的p16基因和hMSH2基因仍有甲基化条带的出现。
5、镉转化不同阶段16HBE细胞中hMSH2基因蛋白表达情况经过免疫组织化学(SP法)检测,DNA错配修复基因hMSH2在非转化16HBE细胞和转化初期细胞中呈现强阳性表达,但随着恶性转化程度的增加,其表达逐渐减弱,至接种裸鼠成瘤细胞中呈现阴性表达。
结论：
1、在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中,可见p16基因和hMSH2基因出现甲基化不同程度的改变,且恶变程度越高,甲基化程度的改变越明显,提示甲基化改变可能是镉重要的表遗传致癌机制之一,甲基化状态可作为镉早期接触和效应分子标志物的参考指标。
2、在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中,hMSH2修复基因启动子区的甲基化与蛋白表达呈负相关,提示hMSH2基因的高甲基化可能致使蛋白表达的下降,进而影响其正常行使错配修复的功能,这可能与镉的致肿瘤作用有关。
3、原来存在基因启动子区CpG岛高甲基化的细胞经过去甲基化处理后,部分细胞中的p16基因和hMSH2基因又恢复了正常的未甲基化状态,说明了部分抑癌基因及错配修复基因甲基化状态的可逆性。