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背景与目的:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑实质出血,是常见的急性脑血管疾病之一,约占脑血管疾病的10-15%,其发病率、病死率以及致残率高,在亚洲尤其是我国尤为突出。虽历经多年研究,至今其发病机制不甚清楚、治疗手段有限。因此,深入研究ICH后神经损伤机制及其防治措施,具有重要的临床意义。已有研究显示,在ICH引起神经损伤最终致残、致死的机制中有两个重要因素,一是ICH早期血肿的机械压迫、占位效应,对脑组织结构的破坏损伤;另一方面是后期血肿成分及其代谢产物引起的继发性神经损伤。但是针对早期血肿物理占位效应的血肿清除术治疗的大型临床试验却未取得预期良好的临床效果。因此,近年来ICH继发性神经损伤的机制及其防治成为ICH研究领域的新热点。大量的研究表明,由血肿成分激发的炎症反应在ICH继发性神经损伤中具有重要作用,成为ICH继发性神经损伤中的研究热点。Toll样受体(TLRs)是一类跨膜受体,可识别特异性外源性及内源性配体,是机体的天然防御机制之一,在天然免疫中具有重要作用。我们既往的研究发现ICH后血肿主要成分Hb通过激活小胶质细胞上的TLR4受体,通过My D88/TRIF信号途径,产生大量的炎症因子(TNF-α、IL-1β等),导致ICH继发性炎症损伤,提示Hb/TLR4途径参与了ICH炎症损伤。但是我们也发现,单独抑制TLR4功能并不能完全抑制ICH的炎症损伤,提示可能还存在其他的机制协同TLR4启动了ICH的继发性炎症损伤。蛋白的异源二聚体形成是蛋白发挥相互作用的重要方式,其重要的意义之一就是在于通过二聚体形成,促使各自蛋白结构发生改变,促使和下游相应的信号通路分子结合及信号转导,最终将各自效应呈级联反应的方式放大。既往在感染性及非感染性炎症疾病的炎症损伤机制中,TLRs在介导炎症损伤时并非是单独发挥作用,而是通过受体间相互协同发挥效应的,其中TLRs形成异聚体是重要的协同方式。脑缺血炎症损伤中为TLR1/TLR2、TLR2/TLR6二聚体,而在动脉粥样硬化、老年痴呆中却为TLR4/TLR6二聚体。TLRs二聚体的发现是近年天然免疫研究领域的重要进展之一,对于阐明TLRs调控炎症反应有重要意义。有研究显示外周单核细胞上高表达TLR2以及TLR4与ICH的继发性脑损伤有关,提示TLR2也参与了ICH继发性神经损伤。但是TLR2在ICH继发性神经损伤中的具体作用仍不甚清楚。TLR2是否和TLR4相互作用仍有待进一步研究。因此在本研究中,我们首先应用小鼠自体血ICH模型,进一步研究TLR2在ICH炎症损伤中的作用。在此基础上,利用离体及在体ICH模型,探讨了TLR2与TLR4在ICH继发性炎症损伤中的关系。最后观察了中药提取物Ssn B对ICH炎症损伤的治疗作用。第一部分:TLR2在小鼠脑出血继发性损伤中的作用目的:明确TLR2在ICH后的表达变化及其在继发性炎症损伤发挥的作用方法:制备WT及TLR2-/-小鼠自体血ICH模型,PCR及WB检测血肿周围组织中TLR2表达变化情况,同时检测小鼠脑水肿含量、炎症因子表达及神经功能缺损情况,明确TLR2在ICH继发性炎症损伤中发挥何种作用。同时明确ICH后导致神经功能缺损的主要成分。结果:1、PCR结果显示TLR2在ICH小鼠(6h、1d、3d、5d)血肿周围组织中表达增高,以ICH 1d表达最高;WT结果与PCR结果一致。免疫荧光共标和流式细胞计数发现,TLR2在小胶质细胞上表达最多,而在神经元上表达无明显改变。2、TLR2-/-小鼠与WT、TLR1-/-、TLR6-/-小鼠相比,TLR2-/-小鼠神经功能缺损评分较低、脑水肿含量减轻、血肿周围组织中炎症因子含量较少,同时血肿周围组织中凋亡及变性的神经元数量较对照组有所减少。TLR2-/-小鼠较其他小鼠血肿周围组织中浸润的炎症细胞更少。3、WB结果显示,血液成分中的红细胞可以导致TLR2表达增高。进一步利用红细胞裂解产物刺激小胶质细胞后发现,只有血红蛋白(Hb)组TLR2的表达增高最明显。同时Hb可以促进小胶质细胞的活化,导致前炎症因子含量的增多。而在预先利用TLR2拮抗剂的WT小鼠以及TLR2-/-小鼠中,血肿成分Hb的作用则明显减轻。4、在Transwell实验中,当Transwell小室中的小胶质细胞利用Hb刺激后再转入神经元培养板,神经元的存活率明显下降。而在TLR2-/-小鼠小胶质细胞中加入Hb刺激后,将其转入神经元培养板之后,神经元的存活率明显增高。5、利用纹状体注射Hb的方法模拟ICH,结果发现TLR2-/-小鼠较WT小鼠的神经功能缺损更轻、脑水肿含量减少、凋亡和变性的神经元更少,同时前炎症因子的含量也明显减少。结论:ICH导致血肿周围组织中小胶质细胞上TLR2表达增高。表达增高的TLR2介导了脑出血继发性炎症损伤,TLR2-/-小鼠NDS评分减少、脑水肿含量下降、炎症因子表达降低,而且血肿周围组织中凋亡与变性的神经元数量明显减少。TLR2-/-小鼠血肿周围组织中外周浸润而来的炎症也较WT组小鼠明显减少,提示我们TLR2在ICH继发性炎症反应中发挥了重要作用。在血肿成分中,Hb是导致TLR2活化最主要的成分。第二部分:小胶质细胞上TLR2/TLR4二聚体启动小鼠ICH炎症反应目的:确认TLR2/TLR4二聚体的形成及其在ICH继发性炎症损伤中的作用方法:利用免疫共沉淀技术及免疫荧光共标技术检测TLR2/TLR4是否有相互作用,同时明确导致二者相互作用的血肿成分。利用TLR2、TLR4双敲除小鼠制备ICH模型,评价TLR2-/-/TLR4-/-小鼠、TLR2-/-小鼠及TLR4-/-小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量及炎症因子表达变化情况。然后利用荧光素报告基因检测方法及哺乳动物双杂交系统进一步确认TLR2/TLR4二聚体的形成。明确TLR2/TLR4二聚体的下游信号通路,利用si RNA技术筛选TLR2/TLR4结合的重要位点。结果:1、免疫共沉淀检测到TLR2/TLR4二聚体的形成,在ICH后1天最高;同时免疫荧光共标染色检测到血肿周围组织中TLR2和TLR4荧光共标。进一步利用离体细胞筛选出ICH后,只有血肿成分Hb可以诱导TLR2/TLR4二聚体的形成。免疫共沉淀也检测到Hb刺激后细胞上TLR2/TLR4的荧光共标。细胞双杂交系统显示,只有在同时转染了TLR2和TLR4的情况下,Hb刺激后NF-kappa B的表达明显高。2、荧光素报告基因显示,HEK293转染不同的TLRs基因后用不同刺激因子,Hb对NF-kappa B的活化最明显。同时在体ICH模型结果提示,TLR2-/-/TLR4-/-小鼠较TLR2-/-小鼠或者TLR4-/-小鼠神经功能缺损评分较轻、脑水肿含量下降、炎症因子表达含量下降。3、TLR2/TLR4二聚体可以在WT和TRIF-/-脑出血后血肿周围组织中检测出来,而My D88-/-小鼠中则没有。突变My D88-196位氨基酸之后,不能导致共转染了TLR2和TLR4的HEK293细胞中NF-kappa B荧光素的表达,而突变My D88-288位氨基酸之后则无此现象。结论:脑出血后血肿主要成分Hb可引起TLR2/TLR4异源二聚体的形成,TLR2-/-/TLR4-/-小鼠较TLR2-/-和TLR4-/-小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量及炎症因子表达均减少,提示该二聚体的形成具有炎症放大效应。同时My D88对TLR2/TLR4二聚体的形成很重要,My D88-196可能是TLR2/TLR4二聚体形成的重要位点之一。第三部分:干预TLR2/TLR4二聚体的形成对ICH的治疗作用目的:探讨抑制TLR2/TLR4二聚体的形成对ICH炎症损伤的治疗作用方法:免疫共沉淀检测Ssn B及其衍生物对TLR2/TLR4二聚体形成的影响,液质联用质谱(LC-MS)检测筛选出的化合物能否通过血脑屏障。免疫共沉淀检测目的化合物抑制TLR2/TLR4二聚体形成的剂量关系,同时利用荧光素报告基因检测目的化合物对Hb导致的NF-kappa B活化的影响。最后通过制备小鼠ICH模型,验证目的化合物对ICH小鼠、神经功能缺损评分、脑水肿含量及炎症因子表达变化的影响。结果:1.在Ssn B及其衍生物中,Ssn B对TLR2/TLR4二聚体形成的抑制作用最强;同时其抑制作用呈剂量关系,20μM可完全抑制HEK293细胞上TLR2/TLR4二聚体的形成。2.Ssn B可以显著抑制Hb诱导的NF-kappa B的表达,而突变My D88第196氨基酸之后Ssn B的抑制作用消失。3.Ssn B减轻小鼠脑出血后神经功能缺损功能评分,减少脑水肿含量,降低血肿周围炎症因子的表达。结论:Ssn B可抑制TLR2/TLR4二聚体的形成,从而减轻ICH后的炎症损伤。