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背景与目的
不孕症是世界范围内的公共卫生问题，全世界约有9%的夫妇患有不孕症。随着现代医学的发展，辅助生殖技术的临床应用越来越广泛，其成功率也在逐渐提高，相对较低的种植率和临床妊娠率是体外受精技术(In vitro fertilization, IVF)发展的瓶颈。控制性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation, COH)是IVF的关键步骤，应用外源性促性腺激素刺激多个卵泡发育的同时，会过度刺激卵巢分泌超生理剂量的雌激素和孕激素，激素分泌紊乱不利于围着床期子宫内膜的发育，导致子宫内膜容受性与胚胎发育不同步，从而导致着床障碍和早期妊娠丢失。中医药在治疗不孕症等妇科疾病方面积累了丰富的经验。根据传统中医理论，肾主生殖，为先天之本，且女子以血为本、以气为用，肾气虚和冲任气血失调是不孕症的常见原因，而补肾、活血是治疗妇科疾病的常用方法。补肾活血方作为调经助孕的基础方，在临床上常用于治疗IVF患者反复种植失败，且经过多年临床实践其疗效逐渐被证实。但补肾活血方对COH导致的胚胎着床障碍的影响及具体作用机制仍有待进一步研究。本研究通过建立COH小鼠着床障碍模型，探索补肾活血方对COH小鼠胚胎着床的影响及其具体作用机制。
方法
首先，比较不同的促排卵方案来建立小鼠COH胚胎着床障碍模型，通过腹腔注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行促排卵：PMSG5IU+hCG5IU、PMSG10IU+hCG10IU、PMSG30IU/100g+hCG30IU/100g、PMSG40IU/100g+hCG40IU/100g以及PMSG40IU/100g+hCG100IU/100g。比较小鼠妊娠率和平均着床位点数，确定构建该模型的PMSG和hCG最佳剂量。
随后，通过确定的促排卵方案构建COH小鼠胚胎着床障碍模型，并用补肾活血方干预。将雌性昆明小鼠随机分为6组：对照组(Control)、中剂量补肾活血方自然妊娠组(Control+BSHXR-M)、模型组(Model)、低剂量补肾活血方组(BSHXR-L)、中剂量补肾活血方组(BSHXR-M)和高剂量补肾活血方组(BSHXR-H)。Model、BSHXR-L、BSHXR-M和BSHXR-H组小鼠腹腔注射PMSG(40 IU/100 g)和hCG(100 IU/100 g)进行超促排卵。Control和Control+BSHXR-M组在相同的时间点腹腔注射等量的生理盐水。hCG注射后(对照组为生理盐水)，将处于动情期的雌性小鼠与雄性小鼠合笼。在次日早上检查雌性小鼠阴栓，见栓日定义为妊娠第1天(D 1)。中药组的小鼠从妊娠D1开始用相应剂量的补肾活血方中药灌胃：BSHXR-L(5.7 g/kg/d)，Control+BSHXR-M和BSHXR-M(11.4 g/kg/d)，以及BSHXR-H(22.8 g/kg/d)。对照组和模型组在相应时间点给予等体积蒸馏水灌胃。所有孕鼠每天灌胃1次，持续至处死日。在D8处死部分小鼠，记录各组小鼠的妊娠率及着床位点数。通过放射性免疫法检测各组小鼠D4血清中雌激素和孕激素水平。通过免疫组化法和WesternBlot法定位、定量检测D4小鼠子宫内膜上容受性标志物上皮细胞钙黏素(E-cadherin)、整合素β3(ITGB3)及同源框基因A10(Hoxa 10)蛋白的表达，雌激素受体(ERα)及下游靶蛋白LIF和HB-EGF蛋白的表达，以及孕激素受体(PR)及靶蛋白印度刺猬因子(Ihh)的表达。
结果
不同剂量的PMSG和hCG组合促排卵结果显示，按小鼠体重腹腔注射40IU/100gPMSG和hCG100IU/100g能够显著降低小鼠D8妊娠率和着床位点数，采用该方案构建小鼠着床障碍模型。中剂量补肾活血方不影响自然妊娠小鼠的妊娠率和着床位点数。低、中和高剂量的补肾活血方均可增加COH小鼠妊娠率和着床位点数，减少早期妊娠丢失。COH小鼠子宫内膜容受性标志物E-cadherin、ITGB3及Hoxa10蛋白的表达显著受损，而补肾活血方可上调E-cadherin和ITGB3蛋白的表达，改善子宫内膜容受性，加强母体-胚胎分子对话，促进胚胎着床。COH过度刺激卵巢导致雌、孕激素分泌紊乱，过度升高的血清性激素导致子宫内膜上的ERα和PR蛋白表达下调，进一步降低其下游靶蛋白LIF、HB-EGF及Ihh蛋白的表达，导致着床窗口期子宫内膜上皮-基质细胞功能紊乱，而补肾活血方可调节卵巢性激素的过度分泌，上调子宫内膜中ERα和PR的表达，促进其下游信号通路的激活，使着床窗口期子宫内膜上皮-基质细胞对话正常进行，促进胚胎着床和随后的子宫内膜蜕膜化，从而改善COH小鼠妊娠结局。
结论
本研究通过建立超促排卵小鼠着床障碍模型，发现补肾活血方可以增加子宫内膜容受性标志物的表达，促进着床窗口期母胎对话，改善超促排卵导致的胚胎着床障碍。进一步研究发现补肾活血方可以控制超促排卵小鼠卵巢性激素的过度分泌，促进子宫内膜中雌、孕激素受体的表达，激活其下游信号通路，促进子宫内膜上皮与基质之间的相互作用，有利于胚胎着床和子宫内膜蜕膜化。此外，补肾活血方不影响自然妊娠小鼠的胚胎着床。
不孕症是世界范围内的公共卫生问题，全世界约有9%的夫妇患有不孕症。随着现代医学的发展，辅助生殖技术的临床应用越来越广泛，其成功率也在逐渐提高，相对较低的种植率和临床妊娠率是体外受精技术(In vitro fertilization, IVF)发展的瓶颈。控制性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation, COH)是IVF的关键步骤，应用外源性促性腺激素刺激多个卵泡发育的同时，会过度刺激卵巢分泌超生理剂量的雌激素和孕激素，激素分泌紊乱不利于围着床期子宫内膜的发育，导致子宫内膜容受性与胚胎发育不同步，从而导致着床障碍和早期妊娠丢失。中医药在治疗不孕症等妇科疾病方面积累了丰富的经验。根据传统中医理论，肾主生殖，为先天之本，且女子以血为本、以气为用，肾气虚和冲任气血失调是不孕症的常见原因，而补肾、活血是治疗妇科疾病的常用方法。补肾活血方作为调经助孕的基础方，在临床上常用于治疗IVF患者反复种植失败，且经过多年临床实践其疗效逐渐被证实。但补肾活血方对COH导致的胚胎着床障碍的影响及具体作用机制仍有待进一步研究。本研究通过建立COH小鼠着床障碍模型，探索补肾活血方对COH小鼠胚胎着床的影响及其具体作用机制。
方法
首先，比较不同的促排卵方案来建立小鼠COH胚胎着床障碍模型，通过腹腔注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行促排卵：PMSG5IU+hCG5IU、PMSG10IU+hCG10IU、PMSG30IU/100g+hCG30IU/100g、PMSG40IU/100g+hCG40IU/100g以及PMSG40IU/100g+hCG100IU/100g。比较小鼠妊娠率和平均着床位点数，确定构建该模型的PMSG和hCG最佳剂量。
随后，通过确定的促排卵方案构建COH小鼠胚胎着床障碍模型，并用补肾活血方干预。将雌性昆明小鼠随机分为6组：对照组(Control)、中剂量补肾活血方自然妊娠组(Control+BSHXR-M)、模型组(Model)、低剂量补肾活血方组(BSHXR-L)、中剂量补肾活血方组(BSHXR-M)和高剂量补肾活血方组(BSHXR-H)。Model、BSHXR-L、BSHXR-M和BSHXR-H组小鼠腹腔注射PMSG(40 IU/100 g)和hCG(100 IU/100 g)进行超促排卵。Control和Control+BSHXR-M组在相同的时间点腹腔注射等量的生理盐水。hCG注射后(对照组为生理盐水)，将处于动情期的雌性小鼠与雄性小鼠合笼。在次日早上检查雌性小鼠阴栓，见栓日定义为妊娠第1天(D 1)。中药组的小鼠从妊娠D1开始用相应剂量的补肾活血方中药灌胃：BSHXR-L(5.7 g/kg/d)，Control+BSHXR-M和BSHXR-M(11.4 g/kg/d)，以及BSHXR-H(22.8 g/kg/d)。对照组和模型组在相应时间点给予等体积蒸馏水灌胃。所有孕鼠每天灌胃1次，持续至处死日。在D8处死部分小鼠，记录各组小鼠的妊娠率及着床位点数。通过放射性免疫法检测各组小鼠D4血清中雌激素和孕激素水平。通过免疫组化法和WesternBlot法定位、定量检测D4小鼠子宫内膜上容受性标志物上皮细胞钙黏素(E-cadherin)、整合素β3(ITGB3)及同源框基因A10(Hoxa 10)蛋白的表达，雌激素受体(ERα)及下游靶蛋白LIF和HB-EGF蛋白的表达，以及孕激素受体(PR)及靶蛋白印度刺猬因子(Ihh)的表达。
结果
不同剂量的PMSG和hCG组合促排卵结果显示，按小鼠体重腹腔注射40IU/100gPMSG和hCG100IU/100g能够显著降低小鼠D8妊娠率和着床位点数，采用该方案构建小鼠着床障碍模型。中剂量补肾活血方不影响自然妊娠小鼠的妊娠率和着床位点数。低、中和高剂量的补肾活血方均可增加COH小鼠妊娠率和着床位点数，减少早期妊娠丢失。COH小鼠子宫内膜容受性标志物E-cadherin、ITGB3及Hoxa10蛋白的表达显著受损，而补肾活血方可上调E-cadherin和ITGB3蛋白的表达，改善子宫内膜容受性，加强母体-胚胎分子对话，促进胚胎着床。COH过度刺激卵巢导致雌、孕激素分泌紊乱，过度升高的血清性激素导致子宫内膜上的ERα和PR蛋白表达下调，进一步降低其下游靶蛋白LIF、HB-EGF及Ihh蛋白的表达，导致着床窗口期子宫内膜上皮-基质细胞功能紊乱，而补肾活血方可调节卵巢性激素的过度分泌，上调子宫内膜中ERα和PR的表达，促进其下游信号通路的激活，使着床窗口期子宫内膜上皮-基质细胞对话正常进行，促进胚胎着床和随后的子宫内膜蜕膜化，从而改善COH小鼠妊娠结局。
结论
本研究通过建立超促排卵小鼠着床障碍模型，发现补肾活血方可以增加子宫内膜容受性标志物的表达，促进着床窗口期母胎对话，改善超促排卵导致的胚胎着床障碍。进一步研究发现补肾活血方可以控制超促排卵小鼠卵巢性激素的过度分泌，促进子宫内膜中雌、孕激素受体的表达，激活其下游信号通路，促进子宫内膜上皮与基质之间的相互作用，有利于胚胎着床和子宫内膜蜕膜化。此外，补肾活血方不影响自然妊娠小鼠的胚胎着床。