论文部分内容阅读
用系统的数据和理论体系指导生物产品分离纯化、制造工艺和研发设计是生物化工领域科学家和工程师的一个梦想和终极目标，是当前的一个重要的科学前沿，也是蛋白质药物产业发展的重大需求。建立生物加工过程的系统化研究策略，为生物化工分离纯化各单元操作的基础科学数据测定积累，建立统一数据库和理论体系，不仅是学科发展的基础，更是产业发展的要求。
目前建立蛋白质分离纯化工艺的研发策略仍然是逐个蛋白产品单独进行，而且几乎完全依赖实验方法，结果是本领域的研究资料以描述型和经验型为主，数据分散在每篇研究论文中，不成体系，也难以系统地总结归纳。生物加工过程的系统化研究旨在挖掘生物产品在生物制造单元中的行为规律，系统的表述规律，并利用规律指导工艺建立、优化和规模生产。这项研究具有研究对象宽泛，包括了典型生物产品和宿主背景物质;实验方式统一且高通量，方便建立统一数据库;数据量大，需要挖掘数据中的规律以使其被系统利用;简明的表述方式，以降低规律模型利用的难度。
本课题围绕着生物制造过程的系统化研究策略建立这一目标，利用四个实例探索了以下三个关键问题:
1)生物产品在生物制造单元中的行为规律如何高效的获取?
2)生物产品在生物制造单元中的应对工艺条件的耐受度如何测定?
3)生物产品在生物制造单元中行为规律如何表述和利用?
在第一章中，我们借鉴超微系统(Ultra scale-down)的研究理念，利用TR-PCR，在使用极少物料，较短时间的情况下，研究了大肠杆菌工程菌质粒DNA和染色体DNA受热释放的规律。质粒DNA和染色体DNA释放量随温度升高和处理时间延长而增加，但在两者达到相同释放量所需的温度和时间存在显著差异;在各处理温度下质粒DNA和染色体DNA的释放量均可被一阶方程拟合，两者的拟合参数亦呈现显著差异。通过对质粒DNA和染色体DNA受热释放模型的操作界面化(Windows of Operation)，模型能够被有效利用指导规模生产。
在第二章中，依旧利用TR-PCR和荧光标记办法，我们考察了荧光标记蛋白的热可逆耐受规律。蛋白质存在可逆耐受温度阈值，表现在在阈值温度以下，蛋白荧光的升温轨迹和降温轨迹可以重合，阈值温度以上荧光的升温轨迹和降温轨迹不能重合，且轨迹之间的差异随处理温度升高而加大。对各处理温度下荧光轨迹进行分析后发现，荧光轨迹的变化规律与各温度处理下蛋白质活性的残留率成正相关。课题建立的蛋白耐受度测定方法首次将蛋白耐受值与蛋白质生物活性关联起来。
在第三章中，我们利用前期建立的mRNA快速定量技术和积累的(数)了mRNA作为细菌产生的一种中间产物，以经典的Logistic和Luedeking-Piret方程为基础，建立动力学模型，较好的描述了生物量，mRNA丰度与产物浓度的变化规律。基于该模型，将mRNA的形成速率与产物的形成速率关联发现，从菌体对数初期到对数中期两者成正相关，mRNA的形成快速激发了产物形成;对数中期后，mRNA形成可能受PCA高浓度抑制快速降低，但PCA的生成速率没有同比例降低，而是缓慢降低，提示可能存在phzC mRNA之外的后期调控以防止PCA合成的过快终止。
在第四章中，我们使用蛋白组学分析方法和典型基因工程宿主大肠杆菌抽提蛋白样品，建立复杂蛋白组分体系高通量等电点沉淀测定方法，并研究大肠杆菌抽提蛋白等电点沉淀规律。发现大肠杆菌蛋白在等电点沉淀过程中的行为表现既有符合经典等电沉淀理论的:即大肠杆菌蛋白组在各个pH操作条件下所得蛋白沉淀量与大肠杆菌蛋白组理论pⅠ分布趋势基本吻合;也有偏离经典等点沉淀理论的行为:在对各酸性等电点沉淀操作条件下的高丰度蛋白进行统计，发现有45％的蛋白在其理论等电点左右（理论pⅠ±0.5）检测到的肽段数最多，符合等电点沉淀理论。有55％的蛋白在其理论pⅠ附近（理论pⅠ±0.5）并无最多沉淀，不符合等电点沉淀理论。观察符合等电点沉淀理论蛋白的分子量、Gravy value与理论pⅠ分布较分散，且不存在明显规律;而不符合等电点沉淀蛋白的Gravy value与理论pⅠ有明显的相关性且可被模型描述。
以上四个实例提示我们，要将生物加工过程的研究系统化，可以借鉴超微系统研究办法，建立统一实验方案，模拟典型规模制造单元;以典型宿主物质为研究对象，利用蛋白质组学分析技术，高通量获取生物产品在生物制造单元中行为数据;充分利用经典模型，辅助发现数据间的关联性;建立操作界面的表述方式能够降低模型利用的门槛。